2021—2023 年湖南省无害化处理场CSFV、PRV、PRRSV 污染情况调查

唐亚新，胡巧云，唐小明，王卫国，彭 志，谢怡灵，张 坤，王昌建，鲁杏华，范仲鑫，黎满香

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；2. 湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014）

猪瘟（classical swine fever，CSF）、猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）、猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）均为高度接触性传染病，感染后严重影响猪群健康，给养殖场带来巨大经济损失[1]。PR 是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的，猪只感染后通常表现呼吸困难、神经症状以及母猪流产、产死胎等临床症状。PR 流行具有一定规律性，目前大规模流行已得到有效控制，主要为零星散发[2-3]。CSF 是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、热性、接触性传染病，发病率和死亡率均较高。CSF 流行没有季节性特点，过去以暴发性流行为主，近年来转变为地区性散发流行，且具有一定周期性（一般为3～4 年）[3]。PRRS 的致病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），1996 年中国大陆首次分离到PRRSV，2006 年暴发了以高热、高发病率、高死亡率为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS），给养猪行业造成巨大损失[4-5]。2012年，与美国NADC30 毒株基因组结构类似的PRRSV开始在我国出现，临床被命名为类NADC30 毒株[6]，其极易与其他毒株重组，且重组机制复杂，现己成为威胁我国养猪业发展的主要毒株类型之一。2017 年我国首次报道并分离到类NADC34 毒株，该毒株有发展为优势毒株的趋势[7]，目前市场上所用的商品化疫苗对该毒株不能形成较好的交叉保护力，这给PRRS 综合防控带来了一定困难[8]。

为了解湖南省2021—2023 年无害化处理场病死猪CSFV、PRV、PRRSV 污染情况，对1 825 份组织样品进行了CSFV、PRV、PRRSV 检测，并对2022 年衡南县阳性样品进行了分型及Nsp2基因测序，以期为养殖场疫病防控与诊断提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集湖南省14 个市州无害化处理场病死猪淋巴结、脾脏与耳尖等组织共1 825 份（每头猪采集其中1 种样品）。其中，2021 年从10 个市州共采集样品386 份，衡阳市选取2 个场采集样品80份，其余市州各选取1个场采集样品20～40份，全年采样1 次；2022 年从8 个市州共采集样品352份，从衡南县无害化处理场每月采集样本约20 份，共采集257 份，其余市州各选取1 个场采集样品10～15 份，全年采样1 次；2023 年从14 个市州共采集样品1 087 份，每个市州选取1～2 个场，每个场每月采集样品10 份。样品信息见表1。

表1 14 个市州无害化处理场采集样品种类及数量 单位：份

1.1.2 主要试剂 病毒DNA/RNA 提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；非洲猪瘟病毒（ASFV）、PRV、CSFV、PRRSV 四通道RT-qPCR 检测试剂盒（TG119），NA-PRRSV、HP-PRRSV、类NADC30 毒株三通道RT-qPCR 检测试剂盒（TG120），购自湖南国测生物科技有限公司；反转录试剂盒FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix，购自北京天根生化科技有限公司；2×TransStart Fast Pfu PCR SuperMix，购自北京全式金生物有限公司；6×Loading Buffer、DL 2 000 DNA Marker，购自广州东盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 取组织样品0.2 g 置于2 mL 离心管中，加入1.0 mL 生理盐水，置于组织研磨仪中震荡30 s，8 000g离心3 min 后取上清，按病毒DNA/RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA/DNA。

1.2.2 病原检测 将提取的RNA/DNA 模板用ASFV、PRV、CSFV、PRRSV 四通道RT-qPCR 检测试剂盒进行CSFV、PRV、PRRSV 检测，操作步骤与反应条件参考试剂盒说明书进行，每次检测均设置阴性与阳性对照。结果判定：Ct ≤37 为阳性，Ct ≥40 为阴性，37 ＜Ct ＜40 为可疑，需重提核酸复核，若与之前结果一致则判为阳性。

1.2.3 PRRSV 分型检测 对衡南县无害化处理场PRRSV 阳性样品用NA-PRRSV、HP-PRRSV、类NADC30 毒株三通道RT-qPCR 检测试剂盒进行分型检测。

1.2.4 PRRSVNsp2基因PCR 扩增 参照文献[9]合成PRRSVNsp2基因引物，对20 份衡南县无害化处理场PRRSV 阳性样品进行Nsp2基因扩增。使用反转录试剂盒将总RNA 反转录为cDNA。PCR 反应体系：2×TransStart Fast Pfu PCR SuperMix 12.5 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各1.0 µL，cDNA 模板3.0 µL，DEPC 水7.5 µL。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。扩增的目的片段分别为经典株1 067 bp、HP-PRRSV 967 bp、类NADC30 毒株670 bp。将扩增产物送至北京擎科生物（长沙）有限公司测序。

1.2.5 PRRSVNsp2基因遗传进化分析 用MEGA 5 软件对2022 年衡南县无害化处理场PRRSV 阳性样品Nsp2基因序列进行遗传进化分析。

2 结果

2.1 CSFV、PRV、PRRSV 污染情况

2.1.1 单重污染 结果（表2）显示：1 825 份无害化处理场病死猪样品的CSFV、PRV、PRRSV阳性检出率分别为3.01%、1.81%、30.14%。CSFV 检出率较低，其中2023 年检出率略高，为3.58%；PRRSV 检出率远高于CSFV 和PRV，检出率逐年升高，2023 年检出率达到38.45%。

表2 CSFV、PRV、PRRSV 阳性检出率 单位：%

2.1.2 双重及三重污染 结果（表3）显示：2021—2022 年未检出三重混合污染，2023 年检出1 例三重混合污染，三重污染率为0.05%；2021—2023 年分别检出2 例、5 例、39 例双重污染，呈逐年上升趋势，平均双重污染率为2.52%（46/1 825），且大多是PRRSV 与其他2 种病原的混合污染。

表3 双重及三重污染率 单位：%

2.2 衡南县无害化处理场检测

2.2.1 PRRSV 检测 对2022 年衡南县无害化处理场采集的257 份组织样本进行PRRSV 检测。结果显示，阳性检出率为24.12%（62/257），以春、冬季阳性率较高，分别为38.71%（24/62）、24.19%（15/62），夏季为20.97%（13/62），秋季为16.12%（10/62）。

2.2.2 PRRSV 分型 对衡南县无害化处理场62 份阳性样品进行NA-PRRSV、HP-PRRSV、类NADC30 毒株分型检测，发现NA-PRRSV、类NADC30 毒株、HP-PRRSV 阳性检出率分别为98.39%（61/62）、43.55%（27/62）、20.97%（13/62）。

2.2.3 PRRSVNsp2基因扩增 以20 份衡南县无害化处理场PRRSV 阳性样品为模板，进行Nsp2基因扩增。结果（图1）显示，分别在967、670 bp 处得到与预期大小一致的目的片段。经MegAlign 软件比对分析，1 条序列存在“1+29”个不连续氨基酸缺失，与HP-PRRSV 特征一致；17 条序列存在“111+1+19”个不连续氨基酸缺失，与类NADC30 毒株特征一致。

M. DL 2 000 Marker；1. 阴性对照；6、18、23、24、29、30、31. 阳性样本。图1 PRRSV-Nsp2 基因扩增结果

2.2.4 PRRSVNsp2基因遗传进化分析 结果（图2）显示：6 号样本与HP-PRRSV 代表株HUN4、JXA1 聚为1 个分支；17 条序列与类NADC30 毒株聚为1 个大分支，在该大分支内又分别聚为4 个小分支，且46 号样本单独聚为1 个分支，2 号样本与WUH5 亲缘关系较近。

●为样本序列。图2 PRRSV-Nsp2 遗传进化树

3 分析与讨论

本试验对2021—2023 年湖南省无害化处理场病死猪进行采样检测，发现CSFV、PRV、PRRSV的阳性检出率分别为3.01%、1.81%、30.14%。CSFV 与PRV 均维持在较低污染水平，且CSFV的Ct 值均较高，不排除检测到CSFV 弱毒疫苗的情况，说明湖南省近3 年CSF 与PR 防控效果较好，免疫接种工作成效显著，使猪群获得了较好的免疫保护力。PRRSV 的污染率较高，说明猪群的PRRSV感染较为严重，且PRRS为免疫抑制性疫病，易与其他病原发生混合感染，这增加了PRRS 的防控难度，需引起足够重视。

近年来，CSFV、PRV、PRRSV的临床感染情况越来越复杂[3]，猪只易发生继发或混合感染。李志贤等[10]报道了贺州市2018—2019 年“PRRSV+CSFV”阳性率为0.57%，“PRRSV+PRV”阳性率为0.28%，“PRV+CSFV”阳性率为0；宋玉慧[11]报道了河南省7.53%发病猪群检出“CSFV+PRRSV”，3.42% 发病猪群检出“CSFV+PRV”，6.16% 发病猪群检出“PRRSV+PRV”；徐丽华等[12]发现“PRRSV+CSFV”的双重污染率最高，其次是“PRRSV+PRV”；向乾裕等[1]报道了2019—2021 年湖南洞口地区混合污染情况，发现以双重、三重污染为主。本研究中2021—2023 年湖南省无害化处理场以双重污染为主，“PRRSV+CSFV”阳性率为1.92%，“PRRSV+PRV”阳性率为0.55%，“PRV+CSFV”阳性率最低为0.05%，三重污染只在2023 年检出1 例，与上述报道基本一致。

PRRSV 在3 种病原中检出率最高，因此对衡南县无害化处理场的PRRSV 进行了检测分析。结果显示，PRRSV 主要流行毒株为谱系1 类NADC30 毒株。遗传进化分析发现，17 个PRRSV序列与类NADC30 毒株聚为1 个大分支，在该大分支内又分别聚为4 个小分支，表现出遗传多样性。姚春雷等[13]对2022 年浙江省37 份PRRSV 阳性样品进行测序发现，谱系1 占比最高（23/37）；顾文源等[14]对2022 年—2023 年上半年15 株河北省代表性PRRSV 毒株进行序列测定，发现10 株属于谱系1；刘强德等[15]研究发现，类NADC30 毒株已成为新疆北疆猪场主要流行毒株；Zhou 等[16]发现，我国东部地区类NADC30 株占比较大，检出率有所上升，且流行呈现多样化；Zhao 等[17]发现，DJY-19 起源于北美NADC30 株，之后与我国的TJ、JXA1 株发生了重组。由于PRRSV 缺乏RNA 聚合酶校正功能，基因组在复制过程中易出现碱基突变、插入和缺失等情况，具有高度变异性[18]，因此需持续加强PRRSV 的遗传变异监测，以掌握其变异情况。

4 结论

2021—2023 年，湖南省无害化处理场CSFV、PRV 污染率维持在较低水平，说明这两种疫病的防控效果较好，建议继续做好CSF 和PR 的免疫接种及效果评估工作，防止发生大流行；PRRSV 污染率较高，呈逐年上升趋势，其中类NADC30 毒株为优势流行毒株，需要持续加强PRRSV 的遗传变异监测及养殖场的饲养管理和生物安全管理，以保障猪群生产安全。