鸽腺病毒通用型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

陈 璐，朱明慧，丁 雨，李 阳，亓丽红，房立春，蒋文明，6，王静静，6，刘华雷，李建亮，于晓慧，6

（1. 山东农业大学，山东泰安 271018；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3. 青岛农业大学，山东青岛 266109；4. 宁夏大学，宁夏银川 750021；5. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250199；6. 农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室（南方），山东青岛 266032）

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）为双股线性DNA 病毒，无囊膜，病毒直径为70～90 nm，病毒粒子呈二十面体对称，主要的衣壳蛋白是六邻体蛋白（Hexon）、五邻体蛋白（Penton）和纤维蛋白（Fiber）[1-2]。国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）将禽腺病毒属（Aviadenovirus）分为14 个种：禽腺病毒A—E种、鸭腺病毒B种、鸽腺病毒A种（PiAdV-A）、鸽腺病毒B 种（PiAdV-B）[4]、鹅腺病毒A 种、火鸡腺病毒B—D 种、鹦鹉腺病毒B 种和猎鹰腺病毒B 种[3]。

鸽腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）是鸽群中最常见的一种病原体。PiAdV 分为PiAdV-A和PiAdV-B 两个种。PiAdV-A 种病毒主要引起鸽肝组织弥漫性坏死或突然死亡，病鸽死亡率为10%～13%。该病毒多感染5～6 月龄信鸽，使其采食量下降，比赛成绩受影响[5-7]；但其在肉鸽场扩散速度较慢，持续时间长，患病肉鸽常体质量减轻，病程长达3 个月，可突然出现死亡，累积病死率约15%。PiAdV-B 种病毒主要对1 岁龄以下的雏鸽影响较为严重，导致雏鸽生长停滞，出现呕吐、腹泻、厌食等，偶尔死亡[8]。PiAdV 给我国信鸽和肉鸽养殖业造成了严重经济损失[9]。

对于PiAdV 的诊断主要依靠实验室检测。目前，关于PiAdV 检测方法的研究较少，且并无适用于PiAdV-A 种和PiAdV-B 种病毒的通用型检测方法。因此，亟需建立能够同时检测两种PiAdV的通用型高通量检测方法以用于临床快速诊断。本研究建立了一种特异性强、敏感性高的PiAdV 通用型实时荧光PCR 检测方法，以期为PiAdV 感染的临床快速诊断提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸和临床样品

1.1.1 病毒核酸 禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）、 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、鸽冠状病毒（pigeon coronavirus，PiCoV）、鸽轮状病毒（pigeon rotavirus，RVA）、PiAdV、鸽圆环病毒（pigeon circovirus，PiCV）和鸽疱疹病毒（pigeon herpesvirus，PiHV）核酸，均由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。

1.1.2 临床样品 20 份鸽临床样品来自于山东省某鸽棚，由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。

1.2 主要试剂

Fine pure 病毒DNA/RNA 柱式提取试剂盒（离心柱型），购自GENFINE 公司；PrimerTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye）、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0，购自TaKaRa 公司；ProTaqHS 预混型探针法qPCR 试剂盒Ⅲ，购自艾科瑞公司；pEASY-T5 Zero Cloning Kit， 购自TRAN 公司；TIANprep Mini Plasmid Kit，购自TIANGEN 公司。

1.3 样品处理

剖检病死鸽，取适量肝脏、脾脏等组织于洁净的2.0 mL 离心管内；按体积比1:3 加入PBS 及灭菌小钢珠，置于组织研磨机内充分研磨；反复冻融3 次后，10 000 r/min 离心5 min，收取上清，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.4 核酸提取

按照Fine pure 病毒DNA/RNA 柱式提取试剂盒（离心柱型）说明书，进行病毒核酸提取，将提取的核酸立即用于PCR 扩增或者于-20 ℃保存。

1.5 引物、探针设计与合成

参考GenBank 中已公布的PiAdV-A 种（GenBank 登录号NC024474.1、MW286325.1）和PiAdV-B 种（GenBank 登录号KX673408.1、NC031503.1）病毒pVIII基因序列的共同保守区域，利用Primer express 分析软件，设计通用型特异性引物和TaqMan 探针（表1），引物与探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 实时荧光PCR 引物和探针信息

1.6 阳性质粒标准品制备

以PiAdV 核酸为模板，利用表1 中PiAdV-F和PiAdV-R 引物进行PCR 扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；利用TaKaRa 胶回收试剂盒对PCR 产物进行纯化回收，并克隆至pEASY-T5 载体，转化到Trans-109 感受态细胞中，构建重组质粒，测序鉴定无误后提取细菌质粒。

1.7 标准品质量浓度测定与拷贝数计算

1.7.1 浓度测定 对重组质粒标准品分别进行10、100 倍稀释后，利用Nano Drop 核酸定量仪分别测量其质量浓度，若质量浓度呈10 倍梯度则测量准确。

1.7.2 拷贝数计算 拷贝数（copies/µL） =（6.02×1023）×（ng/µL×10-9）/（DNA length×660）。

1.8 实时荧光PCR 反应体系优化

以重组质粒标准品为模板，按照艾科瑞荧光PCR 试剂盒的说明书配置反应体系，并在此基础上完成反应体系和退火温度优化。

1.8.1 探针浓度优化 固定反应体系中引物终浓度不变，分别加入终浓度为0.15、0.20、0.25、0.30 µmol/L 的探针进行试验，根据实时荧光PCR检测的Ct 值确定最优探针浓度。

1.8.2 退火温度优化 将退火温度分别设置为57、58、59、60 ℃进行试验，每个温度做3 个重复，通过比较不同退火温度下的Ct 值结果确定最佳退火温度。

1.9 标准曲线建立

将阳性质粒标准品进行10 倍倍比稀释，选取5 个梯度，进行实时荧光PCR 试验。以获得的Ct值为Y 轴，重组质粒标准品拷贝数浓度为X 轴，绘制标准曲线。

1.10 特异性试验

以鸽群常见的AIV、NDV、PiCoV、RVA、PiCV、PiHV 等病毒DNA 或cDNA 为模板，进行实时荧光PCR 扩增，评价该方法的特异性。

1.11 敏感性试验

将PiAdV 标准品进行10 倍倍比稀释，取选不同的稀释度进行实时荧光PCR 扩增，每个稀释度做3 份重复。同时利用常规PCR 检测引物[10-11]，对上述模板进行常规PCR 扩增及琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.12 重复性试验

选取5 个浓度梯度的阳性质粒标准品，用同批次配置的实时荧光PCR 反应体系进行检测，重复3 次，计算组内重复变异系数（CV）；再用不同批次配置的实时荧光PCR 反应体系进行检测，重复3 次，计算组间重复CV 值。Ct 值以平均数±方差（X±SD）的形式表示。

1.13 临床样品检测

利用本研究建立的PiAdV 实时荧光PCR 检测方法，对20 份鸽临床样品进行检测，并与临床上常用的常规PCR方法检测结果及测序结果比较分析。

2 结果

2.1 阳性质粒标准品制备

以PiAdV 核酸为模板，对目的片段进行PCR 扩增（图1），扩增产物经纯化回收后克隆至pEASY-T5 载体，构建了阳性质粒标准品p-PiAdV，经PCR 鉴定结果正确。利用公式计算dsDNA 标准品的拷贝数浓度为5.69×1011copies/µL。

M. DL 2 000 DNA Marker；1. 目的片段；N. 阴性对照。图1 PiAdV 目的片段扩增结果

2.2 实时荧光PCR 反应体系优化与建立

2.2.1 探针浓度优化 保持其他反应体系不变，以阳性质粒标准品p-PiAdV 为模板，通过使用不同终浓度的探针进行荧光PCR。结果（图2）显示，0.15 µmol/L 探针的检测下限为5.69×102copies/µL，0.20～0.30 µmol/L 探针的检测下限均为5.69×101copies/µL，故探针浓度选择0.20 µmol/L。

A—D. 探针浓度依次为0.15、0.20、0.25、0.30 µmol/L。图2 不同探针浓度最低检测限的比较结果

2.2.2 退火温度优化 以5.69×106copies/µL 的阳性质粒标准品p-PiAdV 为模板，在其他条件不变的情况下，将退火温度分别设置为57、58、59、60 ℃进行实时荧光PCR，每次做3 个重复。结果（表2）显示，59 ℃时平均Ct 值最小，因此最终选择最佳退火温度为59 ℃。

表2 荧光PCR 退火温度优化结果

2.2.3 反应体系确定 最终确定的一步法实时荧光PCR 反应体系如表3 所示。最佳反应条件：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 35 s，40 个循环。

表3 一步法实时荧光PCR 反应体系

2.3 标准曲线建立

将阳性质粒标准品p-PiAdV 进行10 倍倍比稀释，取5.69×107～5.69×103copies/µL 的质粒标准品为模板，进行实时荧光PCR 反应，绘制标准曲线（图3）。标准曲线中Ct 值和重组质粒标准品拷贝数之间呈现良好的线性关系，获得的曲线方程为Y= -3.571X+ 41.815，相关系数R2= 0.996。

重组质粒标准品拷贝数图3 PiAdV 实时荧光PCR 标准曲线

2.4 特异性试验

以鸽群7 种常见的病毒DNA 或cDNA 为模版进行特异性试验。结果（图4）显示，只有PiAdV-A 种和PiAdV-B 种病毒核酸出现特异性扩增曲线，而其他病毒核酸均无特异性扩增曲线。结果表明，建立的荧光PCR 反应特异性良好。

1. PiAdV-A 种病毒核酸；2. PiAdV-B 种病毒核酸；3～8. 依次为AIV、NDV、PiCoV、RVA、PiCV、PiHV 核酸。图4 PiAdV 实时荧光PCR 特异性试验结果

2.5 敏感性试验

以不同稀释倍数的阳性质粒标准品p-PiAdV为模板，分别用荧光PCR 和普通PCR 方法进行敏感性试验。结果（图5～6）显示，本研究建立的荧光PCR 方法的PiAdV 最低检测限为5.69×101copies/µL，而常规PCR 为5.69×103copies/µL。结果表明，PiAdV 荧光PCR 检测方法的敏感性比常规PCR 高100 倍。

1～8. 阳性质粒标准品拷贝数浓度依次为5.69×107～5.69×100 copies/µL。图5 PiAdV 实时荧光PCR 敏感性试验结果

M. DL 2 000 DNA Marker；1～8. 阳性质粒标准品拷贝数浓度依次为5.69×107～5.69×100 copies/µL；N. 阴性对照。图6 PiAdV 常规PCR 灵敏度试验结果

2.6 重复性试验

结果（表4）显示，组内重复各稀释度标准品间的CV 值为0.11%～1.72%，组间重复各稀释度标准品间的CV 值为0.08%～0.53%，均小于1.8%。结果表明，该检测方法具有良好的可重复性。

表4 PiAdV 实时荧光PCR 重复性试验结果

2.7 临床样品检测

利用本研究建立的PiAdV 通用型实时荧光PCR 方法对20 份临床疑似PiAdV 感染样品进行检测，结果检出8 份阳性样品。随后对8 份阳性PCR 产物进行序列测定，序列比对结果显示，8 份阳性序列均为PiAdV 基因片段。用常规PCR 方法从上述样品中检出3 份阳性样品，两种方法的符合率为75.00%，Kappa 值为0.722（表5）。

表5 PiAdV 荧光PCR 与常规PCR 检测法检测结果比对结果 单位：份

3 讨论

近年来，我国养鸽业逐渐向产业化、规模化发展，鸽子饲养数量逐年增加，人们对鸽群中的疫病也越来越重视[12]。PiAdV 是鸽群中常见的一种病原体，当鸽感染PiAdV 时，主要表现出呕吐、消化停滞[13]，继而出现脱水、体温上升、体质量减轻、排绿色水便或血便等症状，严重的在2～3 d内急性死亡[14-15]。PiAdV 单独感染时，死亡率较低，但与其他病原混合感染时，则会导致鸽群死亡率明显升高，给养鸽业造成了严重的经济损失。

病原的早期诊断是PiAdV 感染防控的关键因素[16]。目前，临床上已有针对PiAdV 的检测方法，其中病毒分离鉴定法是最可靠的检测方式，但该方法对样品的检测周期较长，不利于大规模检测[17]；血清中和抗体技术和普通PCR 检测技术是实验室诊断较常用的方法，但均要求检测样本中的病毒载量较高，且血清中和抗体技术操作环节复杂[18]。此外，国内外仅有基于PiAdV-A 种和PiAdV-B 种病毒单独的核酸检测方法，还未有适用于PiAdV 通用的核酸检测方法。因此，亟需建立针对鸽群PiAdV-A 种和PiAdV-B 种病毒的通用型灵敏特异的高通量快速检测方法，为开展PiAdV感染的早期诊断提供技术储备[19]。

本研究基于鸽群PiAdV-A 种和PiAdV-B 种病毒pVIII基因保守序列设计特异性引物及探针，并对其反应体系及反应条件进行优化，建立了PiAdV通用型实时荧光PCR 检测方法。该方法特异性强、敏感性高、可重复性好。仅对PiAdV 核酸出现特异性扩增曲线；最低检测限为56.9 copies/µL，比常规PCR 检测方法的灵敏度高出100 倍；具有良好的重复性，组内重复CV 值为0.11%～1.72%，组间重复CV 值为0.08%～0.53%。

利用本研究建立的PiAdV 通用型实时荧光PCR 检测方法与常规PCR 方法，同时对20 份临床疑似PiAdV 感染的样品进行病原学检测，荧光PCR 方法检出8 份阳性样品，而常规PCR 方法仅检出3 份阳性样品。结果提示，本研究所建立的PiAdV 荧光PCR 检测方法比临床上常用的常规PCR 检测方法具有更高的灵敏度，进而具有良好的临床诊断性能。综上所述，本研究建立了一种快速、敏感、特异、准确的PiAdV 通用型实时荧光PCR 检测方法，为PiAdV 感染的早期诊断及综合防控提供了必要的技术支持。