Ⅱ型鹅星状病毒VP27 蛋白生物信息学分析

蒋欣芫，吴晓艳，曹 章，赵 静，张 旭，于天浩，张彦龙

（东北林业大学野生动物与自然保护地学院，黑龙江哈尔滨 150040）

鹅星状病毒（goose astrovirus，GAstV）属于星状病毒科成员，是一种无囊膜、单股正链RNA病毒。雏鹅对GAstV 易感，感染后心包、肝、肾等内脏以及关节出现尿酸盐沉积等症状，发病率和病死率均高达50%以上[1]。GAstV 给我国养鹅业带来了严重经济损失。根据全序列核苷酸多样性，GAstV 可分为两个基因群，即GAstV-Ⅰ和GAstV- Ⅱ， 其中GAstV- Ⅱ发病率远高于GAstV-Ⅰ[2]。GAstV 基因组长度约为7.2 kb，包含1个5'非翻译区（UTR）、3个开放阅读框（ORF1a、ORF1b 和ORF2）、1 个3' UTR 和1 个多聚腺苷酸（Poly A）尾。ORF2 基因编码的衣壳蛋白由704个氨基酸构成，包括4 个功能域：S、P1、P2 和酸性C 末端结构域。其中，第425～665 位氨基酸属于P2 结构域，其编码的VP27 蛋白，又称刺突蛋白，位于病毒结构表面[3]。已有研究[4-5]表明，刺突蛋白参与细胞表面相关受体的识别及机体的免疫应答，可诱导机体产生中和抗体，是GAstV 的主要保护性抗原蛋白。

自第一例GAstV感染病例在我国被报道以来，该病已传播至我国各省份，并持续蔓延[6]。由于目前针对GAstV 各蛋白结构、功能和作用机制的研究有限，并且GAstV 具有传播速度快、突变率高和容易重组的特点，因此尚未研发出针对该病毒安全高效的商品化疫苗。本研究通过生物信息学方法对具有良好免疫原性GAstV-Ⅱ ZYL02 株的VP27蛋白结构与功能进行分析，进一步对其B 细胞抗原表位进行预测，以期为GAstV-Ⅱ疫苗研发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 毒株序列

GAstV-Ⅱ ZYL02 株，由东北林业大学野生动物与自然保护地学院分离并保存，经测序获得了其基因组序列（GenBank 登录号OM811460）。该毒株ORF2 基因编码704 个氨基酸，其中VP27 蛋白的氨基酸序列位于第425～665 位。ZYL02 株VP27基因开放阅读框推导的氨基酸序列：QVTPSLVYNFQGERQSTTESCSFLVFGIPQADSRSRYNANITFNVGYRGRTSTSFTLGTHNWWAVMTLSQTGVIFAPPAVGTGVCNTLATAIQHLNPELETAVLRVNTSTTSTGGQITELRNRLNIADGDYVISMGDPQGNRSALYFRNSDQKWVWLWAGDSNPGETFQSFKMPVLINWSVSDSQEQYNARVRMVQYANAQQQTLTDPEEDDDPLSDVTSLFDPTAEDETDFHLAVSLKTS。

1.2 方法

1.2.1 VP27 蛋白主要理化特性分析 利用Expasy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在线软件，分析ZYL02 株VP27 蛋白氨基酸组成、等电点、原子组成及亲疏水性等理化性质。

1.2.2 VP27 蛋白亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽分析 利用PSORT II Prediction 在线软件（http://psort.hgc.jp/form2.html），在线分析VP27 蛋白亚细胞定位；利用ProtScale 在线软件（https://web.expasy.org/protscale/），预测目标蛋白的亲疏水性；运 用SignalP 4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM 2.0在线软件（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）， 分别预测VP27 蛋白是否含有信号肽和跨膜结构域。

1.2.3 VP27 蛋白二、三级结构预测 利用SOPMA 在线软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html），预测VP27 蛋白二级结构特征，计算其所含的α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲及扩展链的数目与百分比；采用Phyer2 在线软件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index），建模并预测VP27 蛋白三级结构。

1.2.4 B 细胞表位预测及可视化 运用BepiPred-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/BepiPred-2.0/）和ABCpred（http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/）两个在线软件综合预测潜在B 细胞抗原表位，其中ABCpred 预测肽长度选择20 aa，阈值设为0.5。将上述预测得到的潜在B 细胞抗原表位通过ToxinPred2（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred2/）、VaxiJen v2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）和IEDB（http://tools.iedb.org/main/）等在线软件分别进行毒性、抗原性、β-转角、表面可及性、灵活性和疏水性分析，以期筛选出优势B 细胞抗原表位，然后使用PyMOL 软件可视化优势B 细胞抗原表位。

2 结果与分析

2.1 VP27 蛋白理化性质分析

利用ProtParam 在线软件对ZYL02 株VP27蛋白进行理化性质分析。结果显示：该蛋白由20种241 个氨基酸组成，其中Thr 占比最高（10.8%），Cys 占比最低（0.8%）；带正电荷残基数（Arg+Lys）共15 个，带负电荷残基数（Asp+Glu）共26 个（表1）。蛋白分子式为C1173H1794N324O382S6，分子质量为26.739 45 kDa，理论等电点为4.59，不稳定指数为41.8，脂肪指数为70.37，平均疏水性（GRAVY）为-0.418。根据ProtParam 软件“不稳定指数大于40 为不稳定蛋白，小于40 为稳定蛋白，GRAVY值在-2～2 范围内属于亲水性蛋白”的规定，判定VP27 为不稳定的亲水蛋白。

表1 ZYL02 株VP27 蛋白氨基酸组成

2.2 VP27 蛋白亲疏水性、亚细胞定位、跨膜区及信号肽预测

利用ProtScale 对ZYL02 株VP27 蛋白亲疏水性的预测结果（图1）显示：该蛋白多肽链中第24位氨基酸处疏水值最大，为2.067，第210 位氨基酸处疏水值最小，为-2.767，整条多肽链中亲水氨基酸残基数量多于疏水氨基酸残基。因此，综合分析VP27 为亲水性蛋白，与2.1 中预测结果一致。TMHMM Server v 2.0 和SignalP 4.1 在线软件预测结果（图2～3）显示，VP27 蛋白无跨膜区和信号肽。利用PSORT II Prediction 在线软件分析VP27蛋白亚细胞定位的结果显示，其定位于细胞质、细胞核、线粒体以及过氧化物酶体中的可能性分别为69.6%、17.4%、8.7%以及4.3%，即VP27 蛋白定位于细胞质的概率最高。

图3 ZYL02 株VP27 蛋白信号肽预测结果

2.3 VP27 蛋白二级、三级结构预测

利用SOPMA 在线软件对ZYL02 株VP27 蛋白二级结构的预测结果（图4）显示：VP27 蛋白中101 个氨基酸组成无规卷曲（random coil，Cc），占总氨基酸的41.91%；70 个氨基酸构成延伸链（extended strand，Be），约占总氨基酸的29.05%；54 个氨基酸构成α 螺旋（alpha helix，Hh），约占总氨基酸的22.41%；16 个氨基酸构成β 转角（beta turn，Tt），约占总氨基酸的6.64%。结果表明，VP27 蛋白二级结构的主要构成为无规卷曲，其次是延伸链。进一步通过Pyhre 在线软件以PDB ID 3ts3 为模板进行VP27 蛋白同源建模，预测的模型覆盖率为79%，置信度为100%。使用PyMOL 软件对该模型进行了可视化，并对α 螺旋、β 折叠和无规卷曲进行了标记，具体结果见图5。

图4 ZYL02 株VP27 蛋白二级结构预测结果

图5 ZYL02 株VP27 蛋白三级结构的可视化模型

2.4 B 细胞表位预测与表位的三维空间位置分析

为更好地评价由BepiPred-2.0 和ABCpred 在线软件预测获得的26 条VP27 蛋白B 细胞表位（表2），利用IEDB 在线软件从抗原性、β-转角结构、表面可及性、柔韧性和亲水性5 个方面进行预测，分别选取得分前10 位的氨基酸序列（表3），再结合VP27 蛋白的二级结构，以及ToxinPred2 和VaxiJen v2 在线软件的预测结果综合分析，共筛选出4 条优势抗原表位（表2），分别位于26～41 aa（FGIPQADSRSRYNANI）、48～57 aa（RGRTSTSFTL）、111～126 aa（TSTGGQITELRNRLNI）、174～189 aa（PVLINWSVSDSQEQYN）。这些表位具有无毒性，抗原性强，处于β-转角，表面可及性大和亲水性高等特点。随后，利用PyMOL 软件将预测的4条优势抗原表位在三级结构模型中进行可视化（图6），从而获得各优势B 细胞抗原表位的相对位置。

图6 ZYL02 株VP27 蛋白优势抗原表位空间结构

表3 ZYL02 株VP27 蛋白IEDB 预测结果

3 讨论

自2017 年Zhang 等[7]首次分离到GAstV 以来，我国各养鹅地区均有关于该病毒的报道。因GAstV毒株具有突变率高、容易重组等特点，其感染防控工作面临较大挑战。现阶段，人们对GAstV 主要抗原蛋白的结构、功能及其与宿主的作用机制认识有限[7]。本研究利用生物信息学软件解析了ZYL02 株VP27 蛋白，旨在探究VP27 蛋白中可作为潜在疫苗的肽段，不仅节省了试验时间和成本，更为制备安全高效的疫苗打下了坚实基础[8-9]。

VP27 蛋白是构成星状病毒刺突的部分，具有诱导中和抗体的功能[10]，且本实验室保存毒株ZYL02 具有良好的免疫原性[11]。GAstV-Ⅱ ZYL02株VP27 蛋白分析结果显示，该蛋白由241 个氨基酸组成，理论等电点为4.59，不稳定系数为41.8，GRAVY 值为-0.418，因此推测VP27 是不稳定的亲水蛋白，这可为病毒蛋白的分离纯化试验提供先验信息。亚细胞定位结果显示，该蛋白主要定位于细胞质，无跨膜结构域和信号肽，推测其可能为非分泌型蛋白，提示真核细胞、大肠杆菌、昆虫细胞-杆状病毒等多种表达系统都可用于该蛋白的高效表达。二级和三级结构预测结果显示，无规卷曲占比最高（41.91%）。因无规卷曲相对松散且易发生扭曲盘旋，多突出在蛋白质表面，有利于与抗体结合，所以该结构特点提示VP27 蛋白产生抗原决定簇区域的概率较高[12]。Phyer2 在线软件以PDB ID 3ts3 为模板构建VP27 蛋白模型，预测的模型覆盖率为75%，置信度达100%，说明构建的模型质量较好，结构合理可靠。建模结果显示，该蛋白是由β 链紧密堆积形成的疏水核和α-螺旋及无规卷曲围绕在外侧构成，与其他禽星状病毒结构相似[13]，为后文B 细胞抗原表位预测提供了支撑。B 细胞介导体液免疫和细胞免疫，具有识别多种抗原的作用，因此对B 细胞抗原表位的预测极其重要[14]。在对B 细胞抗原表位的预测中，通过BepiPred-2.0 和ABCpred 在线软件共预测出26 条抗原表位。本研究根据不同分析方法，将二级结构为无规卷曲和β-转角的区域，与抗原性强、无毒性和表面可及性大的区域结合分析，综合得分高的重叠肽段作为筛选抗原表位的优先选项，最终筛选出4 条优势B 细胞抗原表位，分别位于48～57 aa（RGRTSTSFTL）、26～41 aa（FGIPQADSRSRYNANI）、111～126 aa（TSTGGQITELRNRLNI）、174～189 aa（PVLINWSVSDSQEQYN），优势B 细胞抗原表位具有更高诱导机体相关免疫应答的概率，可供疫苗设计与研究。已有研究[15]表明，B 淋巴细胞受体（BCR）能识别构象表位和线性表位，且识别位置通常处于抗原分子表面。在三维结构中，利用PyMOL 软件对筛选出的4 条优势表位进行定位，发现4 条优势表位均处于VP27 蛋白的顶端表面突出部分，进一步证实了预测的准确可靠。

综上所述，本研究利用生物信息学软件对GAstV-II ZYL02 株VP27 蛋白的特性、结构进行了较为全面系统的分析，并且筛选出4 条基于潜在表位之上的优势抗原表位，为了解VP27 蛋白的生物学功能以及对GAstV 潜在免疫靶点的研究提供了理论及数据依据，也为研制优质高效的GAstV 疫苗奠定了基础。