基因突变通过内质网应激途径介导慢性胰腺炎发病机制的研究进展

马立哲 孙晓茹 刘俊岑 刘牧云 孙畅

1海军军医大学第一附属医院消化内科，上海 200433；2中国人民解放军海军第905医院消化内科，上海 200050

【提要】 内质网应激在慢性胰腺炎发生中具有重要作用。包括PRSS1、SPINK1、CPA1、CEL等易感基因可能通过蛋白质错误折叠引起内质网应激，从而介导慢性胰腺炎的发生。本文围绕基因突变通过该途径介导慢性胰腺炎的发生进行综述。

内质网应激是细胞的一种保护性应激反应。内质网具有特殊膜结构，参与蛋白质的翻译、翻译后加工及质量控制等生理过程。蛋白质的翻译后加工复杂且极易出错，许多生理或病理损伤（如葡萄糖剥夺、氧化损伤、基因突变表达错误折叠蛋白、分泌蛋白合成的简单增加等）均易导致内质网的加工能力达到饱和，引起内质网应激[1]。轻中度的内质网应激可诱导未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）信号转导进行代偿达到细胞自适应的目的，而重度或长期的内质网应激则使细胞从适应程序转至凋亡程序，以清除不可逆损伤的细胞[2-3]。

UPR信号通路主要包括3个分支，分别由跨膜蛋白肌醇依赖酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）启动[4]。当未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内过度累积超过内质网负荷时，分子伴侣蛋白BiP与IRE1、PERK及ATF6解离并导致其活化；但也有学者提出，单独的BiP解离并不总是能够激活内质网应激感受器，未折叠蛋白质和感受器或其他机制的直接作用也可能调节感受器的活化[5-6]。其中，IRE1、PERK从无活性的单体构象转变成可自磷酸化的活性寡聚体形式诱导下游X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1, XBP1）、真核翻译起始因子2A（eukaryotic initiation factor 2A, eIF2a）等信号的活化，而ATF6被切割成活性单体形式发挥作用[7]。激活的UPR信号试图通过翻译衰减、内质网扩张、促进蛋白质折叠、内质网相关降解等多种途径转变内质网应激状态，维持内质网稳态[8-9]；若内质网应激状态不能被转变或持续存在，则UPR信号可能通过增加活化转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)等的表达诱导细胞程序性凋亡[10]。

一、内质网应激与胰腺功能

胰腺作为人体最大的消化器官，可分泌胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多种消化酶及激素。在所有哺乳动物中，腺泡细胞的蛋白质合成率最高，因此腺泡细胞依赖于包括UPR在内的多种机制来维持内质网稳态及蛋白的合成、转运[11-12]。UPR系统作为内质网重要的保护性反应机制，此前的多种研究已证实其各成分在腺泡细胞稳态中的作用。早期的动物研究发现[13-15]，XBP1缺失的纯合子小鼠出现明显腺泡细胞的内质网发育不良和酶原颗粒的减少，提示XBP1对腺泡细胞的发育至关重要；而XBP1缺失的杂合子小鼠显示出更易感染胰腺炎的表征，且在进一步的实验中，显示出XBP1具有保护腺泡细胞免受乙醇诱导的胰腺损伤的效应。PERK缺失的小鼠表现出胰腺腺泡细胞内质网的明显扩张和碎片化改变，以及胰腺β细胞和α细胞的逐步丧失，并发展为糖尿病，提示其在胰腺发育中的重要作用，但是其下游靶点分子CHOP的缺失可保护小鼠胰腺β细胞的形态和功能免受高脂肪饮食所造成的损伤[16-17]。

二、基因突变通过错误折叠和内质网应激机制介导CP发生

自2009年阳离子胰蛋白酶原（cationic trypsinogen 1，PRSS1）的突变体可能通过蛋白质错误折叠引起内质网应激介导CP的发生这一机制被提出后[18]，越来越多与CP发生相关的突变基因被发现可能通过该途径介导疾病的发生，如：羧肽酶A1（carboxypeptidase A1，CPA1）、人胰凝乳蛋白酶C (chymotrypsin C，CTRC)、丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型(serine peptidase inhibitor Kazal type 1，SPINK1)、羧基酯脂肪酶（carboxyl ester lipase，CEL）等[18-22]。

1.PRSS1与内质网应激：2009年美、德等国家的学者率先在动物研究中发现，PRSS1突变体p.R116C和p.C139S产生的胰蛋白酶原水平减少至野生型的20%，但细胞裂解物中胰蛋白酶原水平与野生型接近，区别是突变型p.R116C以不溶性形式存在，且发现内质网应激标志物XBP1在突变体p.R116C和p.C139S中显著升高，提示内质网应激在CP的发生中具有重要作用[18]。此后的研究又陆续发现p.L104P、p.S127C等突变体均可能通过胰蛋白酶原的错误折叠引起内质网应激机制介导CP的发生[23-24]。在诸多PRSS1突变体中，p.D22G、p.K23R、p.K23_I24insIDK等[25-27]是一类可引起胰蛋白酶原错误折叠从而导致其提前自激活的突变体，提前激活的胰蛋白酶可能在细胞内被内质网识别为错误折叠蛋白而被降解，细胞生物化学检测中仅发现CHOP等内质网应激标志物升高，因此推测这种特殊形式的错误折叠可能与CHOP水平的增高及细胞凋亡相关[25]。

2.CPA1与内质网应激：CPA1前体是胰液中仅次于胰蛋白酶的第二大主要成分，约占胰液总蛋白的10%以上[28]。2013年一项大型研究明确了CPA1功能缺失突变与早发性CP明显相关[19]。该研究还发现突变的CPA1对胰蛋白酶的激活、活性及降解无明显影响，但存在CPA1蛋白分泌减少、细胞内滞留及XBP1等内质网应激标志物水平升高，提示CPA1部分功能缺失的突变可能通过蛋白质错误折叠及其引起的内质网应激介导CP的发生。随后的研究陆续发现CPA1突变体p.Ser282Pro、p.K374E等也可能通过该途径介导CP的发生[29]。

3.CTRC与内质网应激：正常情况下，CTRC在肠道中被胰蛋白酶激活，从而发挥控制胰蛋白酶原激活和降解的作用。功能缺失的CTRC突变体引起CTRC分泌减少、酶催化活性降低、抵抗胰蛋白酶激活或胰蛋白酶降解[20]，导致发生CP的风险增加。部分引起CTRC分泌减少的突变（如p.Q48R、p.G61R和p.A73T）在体外实验中被发现引起内质网应激[30]，但是由于CTRC与PRSS、CPA1相比，其在胰腺中表达水平明显较低，且内质网应激的有害影响与错误折叠的蛋白水平有关，部分学者认为CTRC功能缺失突变仅引起较轻的蛋白毒性效应[31]。

4.SPINK1与内质网应激：SPINK1的主要作用是延迟胰蛋白酶原的过早激活，避免胰腺的自我消化。2000年，N34S突变被发现是CP的强危险因素，也是SPINK1最常见的突变之一[32]。随后众多研究发现，N34S突变对SPINK1的表达、分泌及对胰蛋白酶的抑制活性无明显影响[33-34]。有学者提出N34S突变与胰蛋白酶的结合障碍可能是该突变的致病基础[35]。而c.194+2T＞C突变体显示出外显子3的跳跃和SPINK1的表达缺失，提示功能缺失的SPINK1是CP发病风险增加的重要机制[36]。最近的一项研究证明,SPINK1功能缺失突变导致其表达和分泌减少是主要的致病机制，一些罕见的直接影响其反应位点的突变可能与胰蛋白酶结合受损相关[21]。该研究也提示一些罕见突变体（如R65Q）出现SPINK1蛋白分泌减少可能与折叠改变有关。既往研究也报道过一些罕见的SPINK1突变体（如D50E、Y54H）出现SPINK1分泌减少和蛋白细胞内滞留[37-38]，提示可能通过错误折叠引起内质网应激致病。因此，内质网应激在SPINK1突变介导CP发生机制中的作用尚待进一步研究。

5.CEL与内质网应激：CEL在胰腺腺泡细胞中大量存在，人CEL基因和一个串联排列的假基因CELP位于9号染色体q34.13[39]。编码CELP外显子11中的单核苷酸缺失（c.1686delT、c.1785delC）导致一种常染色体显性遗传病，其特征是早发性胰腺外分泌功能不全和MODY8（青年成熟型糖尿病）。随后发现p.C563FSX673和p.C596FSX695等单核苷酸缺失的突变可能产生容易在腺泡内聚集和滞留的CEL，提示其可能通过蛋白质错误折叠引起内质网应激介导CP的发生[22,40]。最近的一项研究[41]通过对比CEL-16R、CEL-HYB及两种非同义单核苷酸多态性CEL-HYB变体（即错义突变c.1463T＞c和c.1643C＞T）的表征进行分析显示，CEL-HYB的错义突变导致CEL蛋白的错误折叠和在内质网中滞留增多，同时发现内质网应激标志物BiP升高，提示CEL可能通过引起内质网应激导致CP的发生。

6.其他：内质网中新生蛋白质的共翻译和翻译后修饰对蛋白质的折叠、稳定性和转运至关重要。过去几年的研究证实了Nε-赖氨酸乙酰化在维持内质网蛋白的稳定性中具有重要作用，部分多肽需经过乙酰化后才能通过分泌途径并完全成熟[42-43]。内质网中乙酰辅酶A转运体（acetyl-CoA transporter 1，AT-1）通过调节胞质中乙酰辅酶A向内质网内转运以维持内质网腔内Nε-赖氨酸乙酰化过程的必须原料——乙酰辅酶A的水平，从而参与其中。最近的一项动物研究证实，腺泡特异性敲除AT-1小鼠可以自发产生轻症至中度重症的CP表现，同时伴有广泛的未折叠蛋白反应和内质网应激标志物的上调[44]，提示内质网自身的蛋白质翻译及翻译后修饰的功能障碍在CP发生、发展中起重要作用。

综上所述，内质网应激在CP的发生和发展中具有重要的作用，故有希望成为CP治疗的潜在靶点。在胰腺中大量表达的PRSS1、CPA1、CEL等蛋白，更可能因为基因突变导致其表达、分泌过程中出现细胞内滞留，引起内质网应激而导致疾病的发生。SPINK1、CTRC等在胰腺中非大量表达的蛋白，也可能因为基因突变导致蛋白在内质网中折叠异常引起内质网应激；但因其表达量较少，引起内质网应激的水平有限，因此相关基因对疾病发生的作用尚待进一步研究。

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