赶黄草活性成分提取及不同部位成分分布对比

向卓亚

朱柏雨1

朱永清1

夏 陈1

陈 松2

(1. 四川省农业科学院农产品加工研究所〔四川省农业科学院食物与营养健康研究所〕,四川 成都 610066;2. 古萃〔古蔺〕生物科技有限公司,四川 泸州 646500)

赶黄草为虎耳科扯根菜属植物(PenthorumchinensePursh)全草,又名水杨柳、扯根菜,主要分布于东北、华北、华南和西南,是四川古蔺县重要农作物及中药材[1]。其富含多种活性成分,主要为类黄酮类、香豆素类、鞣质类、三萜类等,其中黄酮类化合物被认为是其主要活性成分[2-3]。基于其丰富的活性成分,赶黄草常被苗医作为治疗肝病传统药物,现代研究[4-5]表明其具有抗氧化、抗肝炎病毒、酒精/非酒精性肝脏保护等作用。

赶黄草作为新食品原料[6-7],已有不同溶剂提取赶黄草的研究[8],但考察指标仅为槲皮素这一指标。此外,赶黄草作为全草植物,目前市场上通常将其花、叶、茎3个部位分别出售,其中花的价格最高,叶次之,茎最低,可能是由于不同部位的槲皮素含量差异较大[9],而关于赶黄草不同部位各类活性物质分布及抗氧化活性的研究尚未见报道。研究拟以水、乙醇和甲醇作为溶剂提取赶黄草全草中的活性成分,以总多酚、总黄酮含量以及体外抗氧化能力为指标,比较不同溶剂的提取效果。并以赶黄草不同部位(花、茎、叶)为研究对象,采用最佳提取溶剂进行提取,比较不同部位赶黄草活性成分含量差异,为赶黄草的合理开发与进一步利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赶黄草全草:分别于2021年8月和2022年8月在四川省泸州市古蔺县黄荆镇采收,将其花、叶、茎剥离分开,标记为H1、J1、Y1、H2、J2、Y2,自然风干,样品信息见表1,所有样品经粉碎并过80目筛,密封,于-18 ℃保存备用;

表1 供试样品信息来源

没食子酸、儿茶素、原儿茶酸、表儿茶素、芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、阿福豆苷、乔松素葡萄糖苷、槲皮素、山奈酚、没食子酰3苯并、乔松素、赶黄草苷A(纯度≥98%):色谱纯,美国Simga公司;

α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(水溶性VE)、福林酚、三硝基化铝、碳酸钠、没食子酸:分析纯,成都市科龙化工试剂厂;

数控超声波清洗仪:KQ-250DB型,昆山市超声仪器有限公司;

酶标仪:ELX-800型,美国伯腾仪器有限公司;

高效液相色谱仪:1290型,配备自动进样器、二元泵、柱温箱、DAD检测器,美国Agilent公司;

超纯水仪:UPT-11-2T型,四川优普超纯科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取

(1) 溶剂:参照Guo等[10]的方法略作修改,称取1 g赶黄草样品,分别加入8 mL 不同溶剂(水、40%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、40%乙醇、80%乙醇以及100%乙醇),40 ℃超声提取30 min,8 000 r/min离心15 min,残渣重复提取2次,合并3次提取液,定容至25 mL,即为赶黄草全草提取液,过0.22 μm滤膜,于4 ℃保存备用。

(2) 部位:分别称取1 g赶黄草叶、花和茎,加入8 mL 80%乙醇,40 ℃超声浸提30 min,6 000 r/min离心10 min,残渣重复提取2次,合并3次提取液,定容至25 mL,即为赶黄草样品提取液,过0.22 μm滤膜,于离心管中4 ℃保存备用。

1.2.2 总多酚含量测定 参照Xiang等[11]的方法。以没食子酸质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线为y=0.006 5x+0.004,R2=0.999。

1.2.3 总黄酮含量测定 参照Zhang等[12]的方法。以儿茶素质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线为y=0.001 7x+0.001,R2=0.999。

1.2.4 抗氧化活性测定

(1) ABTS自由基清除能力:参照Ma等[13]的方法,以水溶性VE质量浓度为横坐标,ABTS自由基清除率为纵坐标制作标准曲线为y=0.098x-0.140 1,R2=0.992 4。

(2) DPPH自由基清除能力:参照Deng等[14]的方法,以水溶性 VE质量浓度为横坐标,DPPH自由基清除率为纵坐标制作标准曲线为y=0.310 7x+ 0.032 9,R2=0.998 6。

(3) 铁离子还原能力(FRAP):参照Tian等[15]的方法,以水溶性VE质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标制作标准曲线为y=1.786 3x+0.010 6,R2=0.999 8。

1.2.5 多酚类化合物测定 参照朱柏雨等[16]的方法稍作修改,提取物经0.22 μm微孔滤膜过滤后,采用高效液相色谱法进样分析。流动相A为1%甲酸—水溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱:0～10 min, 5%～10% B;10～15 min, 10%～20% B;15～20 min, 20%～35% B;20～30 min,35%～75% B;30～32 min,75%～95% B。Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),检测波长分别为280,350 nm;柱温30 ℃;流量0.8 mL/min;进样量2 μL。15个标准品分别用甲醇溶解,以二倍稀释法制备不同浓度的标准品溶液,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,差异显著性比较使用Duncan多重比较方法,P<0.05表示差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取赶黄草全草活性成分

2.1.1 总多酚、总黄酮含量 由表2可知,不同溶剂提取赶黄草总多酚、总黄酮含量强弱为80%乙醇=40%乙醇≥100%甲醇>80%甲醇>40%甲醇>水>100%乙醇。80%,40%乙醇提取物中总多酚含量显著高于其他溶剂提取物。此外,除100%乙醇外,乙醇提取总多酚的效果总体优于甲醇,其中40%,80%乙醇更有利于获得较高含量的酚类化合物,但乙醇体积分数过高(100%)对酚类物质提取量反而显著降低。酚类物质在水中的溶解度较低,水提物中总多酚含量最低。研究[17-19]表明,多酚易溶于一定浓度的有机溶剂中,不同体积分数的乙醇溶液提取中药材中多酚效果优于水提取物。

表2 不同溶剂提取赶黄草全草中总多酚、总黄酮含量及抗氧化活性†

总黄酮与总多酚含量趋势大致相同,80%乙醇提取物中总黄酮含量最高,水提物的最低。相同溶剂条件下,随着溶剂极性降低,提取物中总黄酮含量显著增加,相同浓度下乙醇提取物中的总黄酮量显著高于甲醇提取物的,一方面可能是由于黄酮类化合物在水中的溶解度低于有机溶剂;另一方面,赶黄草中可能存在大量弱极性黄酮类化合物,极性较低的溶剂容易破坏细胞膜,使其他细胞器中的黄酮类化合物被释放[20]。

2.1.2 抗氧化活性比较 由表2可知,赶黄草全草的DPPH自由基清除能力为8.97～20.67 mg/g。Ismail等[21]指出DPPH在极性溶剂体系中可以清除更多自由基。与其他溶剂提取物相比,80%乙醇提取物的抗氧化能力最高,水提物的最低,可能与其较高含量的总多酚和总黄酮有关。除100%乙醇外,其他溶剂提取物对DPPH自由基清除能力差异不显著(P>0.05)。ABTS自由基清除能力与铁离子还原能力变化趋势大致相似,80%乙醇提取物的抗氧化活性最高,而100%乙醇提取物的最低。Lu等[22]发现,赶黄草醇提物的DPPH自由基清除能力和氧化还原能力高于水提物的。综上,除DPPH自由基清除能力外,ABTS自由基清除能力与铁离子还原能力均为80%乙醇提取物的最高。

2.1.3 15种多酚类化合物含量 由表3和图1(a)可知,80%乙醇提取物中有7种化合物含量最高,分别为儿茶素(2.03 mg/g)、芦丁(0.04 mg/g)、乔松素葡萄糖苷(0.86 mg/g)、槲皮素(0.46 mg/g)、山奈酚(0.32 mg/g)、乔松素(1.12 mg/g)以及赶黄草苷A(88.60 mg/g)。40%乙醇提取物中异槲皮苷(0.39 mg/g)含量最高;80%甲醇提取物中山奈酚-3-O-芸香糖苷(1.18 mg/g)、紫云英苷(1.22 mg/g)和没食子酰3苯并(13.38 mg/g)含量最高,而水提物中没食子酸(1.85 mg/g)和原儿茶酸(0.57 mg/g)含量最高。说明不同溶剂对赶黄草中酚类物质的提取差异较大,80%乙醇是较有前景的提取溶剂,与He等[23]的研究结果一致。范玲等[24]研究发现,相比水提物和95%乙醇提取物,赶黄草中70%乙醇提取物对小鼠内毒素性肝损伤具有明显保护作用。槲皮素在《四川省中药材标准》中作为赶黄草的指标成分,但其含量<1 mg/g且与赶黄草保肝的临床疗效关联性较小[25]。

图1 赶黄草液相图

表3 不同溶剂提取赶黄草中多酚类化合物†

综上,结合总多酚、总黄酮、多酚类化合物提取量,80%乙醇提取赶黄草中活性成分具有更强优势,将作为提取溶剂提取赶黄草不同部位(花、茎、叶)活性成分。

2.2 赶黄草不同部位活性成分比较

2.2.1 总多酚、总黄酮含量 由图2可知,同一收获时期的赶黄草花和叶中总多酚、总黄酮含量显著高于茎,说明赶黄草多酚物质主要存在于叶和花中,与陀扬凌等[9]的结果一致。此外,2022年采收的赶黄草多酚、总黄酮含量顺序均为花>叶>茎,随着贮藏时间的延长,2021年采收的顺序则为叶≥花>茎,花和茎中总多酚、总黄酮含量显著降低,减少了约36%～ 50%,而叶中含量无显著差异,可能是叶中酚类物质性质较花和茎中更稳定,通常酚类物质性质极其活泼,贮藏过程中极易发生氧化[26]。综上,多酚物质主要分布在赶黄草花和叶中,但随着贮藏时间的延长,花和茎中的总多酚、总黄酮含量显著下降(P<0.05)。

小写字母不同代表差异显著(P<0.05)

2.2.2 15种多酚类化合物含量 由表4和图1(b)可知,除儿茶素、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、乔松素葡萄糖苷、槲皮素、没食子酰3苯并以及乔松素外,7种多酚类化合物含量分布情况均为叶>花>茎,与孙佩等[27]的结果一致。花和叶中含量最高的为赶黄草苷A,其次为没食子酰3苯并,与Sun等[28]的结果一致。但与Yin等[29]的结论存在差异,可能是由赶黄草品种、产地等因素导致的。乔松素含量在花中较高,仅次于没食子酰3苯并,在叶和茎中含量较低。赶黄草苷A、乔松素、没食子酰3苯并以及乔松素葡萄糖苷的药理作用与赶黄草的药理作用密切相关,具有保肝护肝活性[3]。槲皮素在花、茎和叶中含量接近,与孙佩等[27]、周滢等[30]的研究结果不一致。此外,赶黄草中表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素以及山奈酚在3个部位的含量均<1 mg/g,且各部位的酚类物质含量随贮藏时间的延长而降低,其中花和茎中酚类物质降低程度最大。

表4 赶黄草不同部位多酚类化合物含量†

2.2.3 抗氧化活性比较 由图3可知,赶黄草不同部位提取物的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力以及铁离子还原能力均为花>叶>茎。随着贮藏时间的延长,赶黄草花和叶中DPPH自由基、ABTS自由基清除能力显著减弱(P<0.05),而叶中铁离子还原能力也显著减弱。不同部位的抗氧化活性变化趋势与总多酚、总黄酮含量变化趋势一致,表明赶黄草提取物的抗氧化活性与总多酚、总黄酮含量有密切关联。

小写字母不同代表差异显著 (P<0.05)

2.3 相关性分析

由表5可知,儿茶素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、阿福豆苷以及乔松素葡萄糖苷、山奈酚均与总多酚含量呈显著正相关(P< 0.05)或极显著正相关(P< 0.01);儿茶素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、阿福豆苷、乔松素葡萄糖苷、山奈酚没食子酰苯并以及赶黄草苷A与总黄酮含量呈显著正相关(P< 0.05)或呈极显著正相关(P< 0.01);而原儿茶酸与总黄酮含量呈显著负相关(P< 0.05)。DPPH自由基清除能力、铁离子还原能力与总多酚含量分别呈显著(P<0.05)或极显著正相关(P<0.01),DPPH自由基清除能力与儿茶素、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、阿福豆苷、乔松素葡萄糖苷以及山奈酚分别呈显著(P<0.05)或极显著正相关(P<0.01),铁离子还原能力与儿茶素、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、阿福豆苷以及乔松素葡萄糖苷分别呈显著(P<0.05)或极显著正相关(P<0.01)。Liu等[31]研究表明,酚类化合物中游离羟基是抗氧化活性的主要原因,而游离羟基数量越多抗氧化活性越强,这可能是酚类化合物与抗氧化活性有较强相关性的原因。

表5 赶黄草中总多酚、总黄酮、多酚化合物与抗氧化活性的相关性†

3 结论

研究先利用不同溶剂提取赶黄草全草中活性成分,再对其总多酚、总黄酮、多酚类化合物含量以及抗氧化活性进行比较。结果表明,提取溶剂类型和溶剂浓度对酚类物质提取能力及抗氧化活性有显著影响。随着溶剂浓度的增加,赶黄草叶提取物中总多酚、总黄酮含量和抗氧化活性大体上呈先升高后降低的趋势,且乙醇的提取能力优于甲醇,而80%乙醇提取物中有7种化合物含量最高。综合比较,80%乙醇提取赶黄草中活性成分具有更强的优势。总多酚、总黄酮、15种多酚类化合物主要分布于赶黄草花和叶中,且叶中的多酚物质稳定。随着贮藏时间的延长,总多酚、总黄酮及多酚类化合物含量显著下降,尤其是花和茎的。后续可以将赶黄草不同部位(花、茎、叶)分开研究和使用,以提高疗效和更大程度开发利用川产赶黄草新食品资源。