小茴香挥发油β-环糊精包合物的制备、表征及稳定性研究

张雨萌

徐 芳2

姚雨含2

李晨阳2

赵 军2

(1. 新疆大学生命科学与技术学院,新疆 乌鲁木齐 830046;2. 新疆维吾尔自治区药物研究所维吾尔药重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830004)

小茴香(Foeniculumvulgare)为伞形科茴香属草本植物茴香的干燥成熟果实,具有散寒止痛、理气和胃的功效,主要含有挥发油、生物碱、黄酮、脂肪酸、甾醇和糖苷等多种类型的化合物[1]。小茴香挥发油主要含有单萜类化合物和苯丙烷类化合物,具有抗炎镇痛、抗菌、增加胃肠蠕动等作用。小茴香挥发油中主要成分为反式茴香脑、D-柠檬烯、γ-萜品烯、茴香酮、雌蒿脑、茴香醛。反式茴香脑在小茴香挥发油中的含量可达到65%～80%[2],此类化合物呈油状具有强烈的茴香香味,存在易挥发、不稳定、对光线和温度敏感等性质,容易氧化分解变质,给挥发油的贮藏、使用以及开发利用带来极大不便[3]。

目前,挥发油多选β-环糊精进行包合,β-环糊精利用分子作用力将挥发油包嵌进空腔结构形成包合物,可明显提高其稳定性,克服挥发性,改善水溶性,降低刺激性气味,以便挥发油更好地在生产生活中使用。郑燕菲等[4]采用饱和水溶液法以包合收率为指标,利用β-环糊精包合八角茴香油制备包合物。谢媛等[5]采用细胞破碎法以挥发油包合率和包合收率为指标,利用纯胶包合小茴香挥发油制备包合物。已有文献报道对小茴香包合物中挥发油的控制指标,大多为传统的包合率和包合收率,对其结构性质鉴定不够全面。研究拟通过正交试验优化得到可提高小茴香挥发油包合率和包合产率的包合工艺,并通过扫描电镜法、薄层色谱法、傅立叶红外光谱法、差示扫描量热法4种方法对包合物进行鉴定,以期将该工艺方法推广应用于食品、医药等领域。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

小茴香:河北百合健康药业有限公司;

β-环糊精:北京凤礼精求医药股份有限公司;

反式茴香脑标准品:成都曼斯特生物科技有限公司;

无水乙醇、石油醚:分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;

甲醇:色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.2 主要设备仪器

高效液相色谱仪:LC-10ATvp型,岛津上海实验器材有限公司;

恒温磁力搅拌器:85-2型,江苏金怡仪器科技有限公司;

场发射扫描电子显微镜:SU8010型,日立科学仪器北京有限公司;

差示扫描量热仪:DSC 404F3型,耐驰科学仪器商贸上海有限公司;

傅立叶红外光谱仪:70 RAM II型,浙江赛德仪器设备有限公司;

澄明度检测仪:YB-2型,天津大学精密仪器厂;

台式高速冷冻离心机:TGL-16型,湖南湘仪实验室仪器开发公司。

1.2 方法

1.2.1 小茴香挥发油制备 采用水蒸气蒸馏法提取小茴香挥发油。小茴香粉碎过10目筛,称取500 g小茴香粉末置于圆底烧瓶中,按料液比1∶12 (g/mL)加蒸馏水浸泡4 h,加热提取5 h。收集蒸馏液,加入约0.1 g/mL的无水硫酸钠干燥,随后过滤得到挥发油,得率为1.9 mL/100 g。小茴香挥发油为淡黄色透明油状物,有轻微的辛辣味,将其置于-20 ℃下贮藏备用。

1.2.2 小茴香挥发油包合物制备工艺研究

(1) 包合物制备:采用饱和水溶液法[6],其流程如下:

β-环糊精8 g→加入6倍量的蒸馏水→磁力搅拌50 ℃→搅拌溶解→挥发油1 mL用无水乙醇4 mL溶解缓慢逐滴加入→恒温搅拌6 min→冷却至室温→4 ℃冷藏24 h→抽滤→石油醚冲洗3次每次1 mL→室温放置过夜→自然挥干→小茴香挥发油包合物

(2) 正交试验设计:根据文献[3]以及预试验结果确定表1所示的因素及数值对包合物制备的影响较大。设计L9(34)正交试验优化小茴香挥发油包合物制备工艺条件。

表1 小茴香挥发油包合物制备工艺正交试验因素水平表

(3) 包合物中反式茴香脑含量测定:适量称取小茴香挥发油包合物,置于10 mL容量瓶中,用无水乙醇定容,于60 ℃下超声处理10 min使包合物中的挥发油充分溶解,取出部分溶液加入2 mL EP管中,于16 ℃、6 000 r/min条件下离心15 min,取上清液,用0.45 μm的有机相滤头过滤,供高效液相色谱(HPLC)测定反式茴香脑含量。

(4) 包合物中含油率测定:称取小茴香挥发油包合物,置于500 mL圆底烧瓶中,加入蒸馏水300 mL,按(2020版《中国药典》四部通则)测定回收的挥发油含量,至油量不再增加时停止加热,放置1 h,读取油量即可。

(1)

式中:

c——挥发油空白回收率,%;

m1——收集到的挥发油质量,g;

m2——加入挥发油质量,g。

(6) 小茴香挥发油及包合物中反式茴香脑含量测定:采用HPLC法,根据文献[7]修改如下:Shim-pack×C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇(A)和水(B)梯度洗脱;梯度洗脱条件:0～19 min为70%～80% A,20～25 min时为80%～90% A;流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长254 nm,进样量10 μL。对照品溶液的配制:取适量反式茴香脑对照品,精密称定后,用无水乙醇稀释溶解配制成质量浓度为9.60 μg/mL的对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0 mL,分别置于10 mL容量瓶中,用无水乙醇定容摇匀,按照上述的色谱条件进样,记录峰面积,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为Y=81 823 535.493X+20 181.300,(R2=0.999);线性范围为0.096～9.60 μg/mL。

(7) 包合率、包合产率及综合评分计算:包合率为衡量包合效果的主要指标,权重系数定为0.5,反式茴香脑是包合物中挥发油的主要成分,反式茴香脑含量越高,说明包合物中的有效成分含量高,因此权重系数定为0.3。包合产率在实际生产中可反映包合效率,权重系数定为0.2[8]。根据式(2)、式(3)和式(4)分别计算包合率、包合产率和综合评分。

(2)

(3)

(4)

式中:

E——包合率,%;

采用HRV时域分析和频域分析法，由计算机自动分析。HRV时域指标:① 全部窦性心搏RR间期的标准差(SDNN)；② 连续24 h正常RR间期标准差的均值(SDNN index)；③ 全程相邻RR间期之差的均方根值(rMSSD)；④ 全程相邻心搏RR间期之差值>50 ms的心搏数占心搏总数的百分比(pNN50)。频域分析指标:低频功率(LF)、高频功率(HF)。

m3——包合物中实际含油质量,g;

m4——制备包合物时加入挥发油的质量,g;

F——包合产率,%;

m5——包合物的质量,g;

m6——制备包合物时加入β-环糊精的质量,g;

H——综合评分;

G——反式茴香脑含量,%;

Emax——包合率的最大值,%;

Fmax——包合产率的最大值,%;

Gmax——反式茴香脑含量的最大值,%。

1.2.3 小茴香挥发油β-环糊精包合物表征

(1) 扫描电镜(SEM)观察:根据文献[9]。称取β-环糊精、物理混合物和最佳工艺下制备的包合物各1.0 mg,在电镜下观察。

(2) 薄层色谱(TLC)分析:将包合物按1.2.2(4)中的方法提取包合的挥发油。以茴香醛为对照,量取包合前的挥发油和最佳工艺下制备的包合物中提取出的挥发油各0.5 mL,分别置于10 mL容量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度。再取包合物30 mg置于2 mL EP管用无水乙醇充分溶解,取上清液。参考《中国药典》2020版一部,小茴香的鉴别方法,分别吸取上述样品5 μL点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚—乙酸乙酯(17∶2.5)为展开剂,展开、取出、晾干,喷以5%二硝基苯肼溶液,日光至斑点显现。

(3) 红外光谱(IR)扫描:根据文献[10]。取挥发油、β-环糊精、物理混合物和最佳工艺下制备的包合物适量,挥发油以溴化钾涂片法制备样品,其余采用溴化钾压片法制备样品,于500～4 000 cm-1波数范围进行红外光谱扫描。

(4) 差示扫描量热(DSC)分析:根据文献[11]。称取β-环糊精、物理混合物和最佳工艺下制备的包合物各5.0 mg,置于铝制坩埚中,用差示扫描量热仪进行分析。测定参数设置:氮气体积流量40 mL/min,升温速度10 ℃/min,升温范围30～480 ℃。

1.2.4 小茴香挥发油包合物稳定性研究

(1) 光稳定性试验:分别称取小茴香挥发油包合物各3份,每份5.0 g,密封于称量瓶中,均照射10 d(强度4 000 lx),每隔5 d取样测定包合率和反式茴香脑含量。

(2) 高温试验:分别称取小茴香挥发油包合物各3份,每份5.0 g,用锡纸包封置于60 ℃恒温干燥箱内放置10 d,每隔5 d取样测定包合率和反式茴香脑含量。

(3) 高湿试验:分别称取小茴香挥发油包合物各3份,每份5.0 g,密封于称量瓶中,每3份在25 ℃环境下,置于相对湿度分别为75%(饱和氯化钠)和90%(饱和硝酸钾)的2个密闭容器中放置10 d,每隔5 d取样测定包合率和反式茴香脑含量。

1.3 数据处理

所有试验均平行3次,以平均值±标准差表示,运用SPSS 20.0软件对所得数据进行显著性分析,利用Origin 2023软件作图。

2 结果与分析

2.1 小茴香挥发油成分分析

如图1所示,小茴香挥发油经β-环糊精包合后,仍有清晰的反式茴香脑图谱。经测定,小茴香挥发油中反式茴香脑含量为(79.16±1.04)%,包合物中反式茴香脑含量为(6.81±0.11)%。

A. 反式茴香脑标准品 B. 小茴香挥发油 C. 小茴香挥发油包合物

2.2 空白回收率试验

通过3次平行试验测定小茴香挥发油的空白回收率,得到小茴香挥发油的空白回收率为83%。

2.3 包合工艺优化

以综合评分为指标对小茴香挥发油包合物制备工艺进行优化。由表2可知,对包合工艺影响程度大小顺序为挥发油与β-环糊精比例>包合时间>包合温度,最佳工艺条件为挥发油与β-环糊精比例1∶8 (mL/g),包合温度40 ℃,包合时间60 min。

表2 小茴香挥发油包合物正交试验评分结果

取小茴香挥发油1 mL,按最佳的包合工艺条件进行3次验证实验,测得小茴香挥发油平均包合率为(96.90±1.76)%,相对标准偏差(RSD)1.81%;包合产率为(93.61±0.62)%,RSD 0.67%;反式茴香脑含量为(6.81±0.11)%,RSD 1.62%,综合评分为99.68,RSD<5%,该包合工艺稳定可行。

由表3可知,挥发油与β-环糊精比例及包合时间对包合率有显著影响(P<0.05),可能是由于β-环糊精用量对包合产率的影响较大;包合时间长,使得挥发油能够更加充分地进入β-环糊精内部,有利于包合物的形成。

表3 综合评分方差分析表

2.4 小茴香挥发油包合物表征

2.4.1 扫描电镜观察 分别取β-环糊精、物理混合物和包合物适量,经导电胶粘样、喷金镀膜后,观察其形貌特征。如图2所示,β-环糊精为大分子的环状低聚糖结构,在1 000放大倍数下,其质地松散,表面粗糙,β-环糊精的形态较大[11],而物理混合物是与挥发油的简单混合物,因此与β-环糊精的形态差异不大。在2万放大倍数下,物理混合物中小茴香挥发油呈小颗粒分散在β-环糊精的表面及四周,并未进入其内部。在包合物的制备中,由于在磁力搅拌的作用下挥发油小分子被打散进入到β-环糊精空腔内部使得其发生形态学变化。同时,在搅拌的过程中由大颗粒块状的β-环糊精细化成了小分子,并且分布均匀,呈棱状。从图2F可以明显地看出,挥发油已进入β-环糊精分子内部,说明包合物的形成。

A. β-环糊精(1 000倍) B. 物理混合物(1 000倍) C. 包合物(1 000倍) D. β-环糊精(2万倍) E. 物理混合物(2万倍) F. 包合物(2万倍)

2.4.2 薄层色谱分析 通过查阅文献[12]发现茴香醛为小茴香挥发油中标识性成分,并在薄层中能很好显现,故选择茴香醛作为对照品。如图3所示,从药材中提取得到的小茴香挥发油成分,与从包合物中提取得到的挥发油成分一致。包合物在薄层色谱与茴香醛相对应的斑点并未显示,说明挥发油已被包合在β-环糊精中[13]。

A. 小茴香挥发油 B. β-环糊精 C. 物理混合物 D. 包合物

2.4.4 差示扫描量热分析 由图5可知,β-环糊精在140 ℃的特征吸收峰是由于样品表面的小分子水、内部结晶水和小分子物质的分解,310 ℃的熔融峰是由于β-环糊精的主链及交联键的断裂,350 ℃左右为β-环糊精的分解峰[16],主要为碳残余的降解;在物理混合物中同样能够明显地看到在140,310,350 ℃左右仍存在β-环糊精空腔中结晶水蒸发的吸热峰、β-环糊精的熔融峰和分解峰,说明物理混合物的结构与β-环糊精的十分相似。但包合物在140 ℃左右出现的吸热峰并不明显,可能是由于包合在β-环糊精空腔中的挥发油将结晶水置换出来[17],推测形成了包合物。在310,350 ℃的吸收峰也较为平缓,是由于在形成包合物后β-环糊精的热稳定性提高。包合物与物理混合物呈现出不同的吸热状态,表明包合物形成[18],与扫描电镜和红外光谱分析的结果一致。

2.5 小茴香挥发油包合物稳定性

2.5.1 光稳定性试验 由表4可知,在连续光照5 d后,包合物的外观性状,包合率和反式茴香脑含量基本保持不变,光照10 d后包合率和反式茴香脑含量发生较小变化,光照对包合物的影响较小[19]。

表4 包合物光照试验结果

2.5.2 高温试验 由表5可知,包合物经高温试验后,其外观发生明显变化,由原本白色粉末变成微黄色,并且出现质量减少的现象。在高温下,由于挥发油的挥发性会从β-环糊精的空腔中溢出,使得包合物重量减轻,出现挥发油似的淡黄色,说明包合物中的挥发油在高温烘烤下会从内部释放,也说明挥发油进入到β-环糊精内部。随着高温时间的延长,包合率及反式茴香脑含量相较于前5 d降低速率减慢,表明包合物具有一定的高温耐受力。但是为了保证挥发油包合物的稳定性以及反式茴香脑含量的稳定,应避免将包合物置于高温下[20]。

表5 包合物高温试验结果

2.5.3 高湿试验 由表6可知,相对湿度为75%时,第5天包合物外观性状变化不太明显,第10天外缘开始潮解,呈结块状,吸湿性增加,包合率和反式茴香脑含量均有所降低。而相对湿度为90%时,第5天包合物就出现明显的结块和粘壁现象,其包合率和反式茴香脑含量也明显降低;第10天包合物出现吸湿溶解现象,呈黏稠状,包合率和反式茴香脑含量显著降低。说明75%湿度下挥发油的包合率和包合物中反式茴香脑含量变化不大,在90%的湿度下对挥发油包合率和包合物中反式茴香脑含量的影响较大,表明常温干燥环境有利于小茴香挥发油包合物的稳定[21]。

表6 包合物高湿试验结果

3 结论

研究采用水蒸气蒸馏法提取小茴香挥发油,通过高效液相色谱法测定小茴香包合物中反式茴香脑含量。以β-环糊精为包合材料,以包合率、反式茴香脑含量、包合产率为指标,由正交试验优化得到挥发油与β-环糊精比例1∶8 (mL/g),包合温度40 ℃,包合时间60 min,在此工艺条件下的包合率为96.90%,包合产率为93.61%,反式茴香脑含量为6.81%,综合评分99.68。该包合工艺操作简便。扫描电镜观察、红外光谱分析、差示扫描量热分析和薄层色谱分析发现,挥发油已成功包合进β-环糊精中,并形成了包合物。稳定性试验表明,小茴香挥发油β-环糊精包合物宜贮藏在常温干燥密封的环境下。后续可将小茴香挥发油包合物作为保鲜剂、抗菌剂、制剂原料等应用于食品、药品中,研究小茴香挥发油包合物中有效成分是否发挥功效作用。