猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

马红伟 , 潘华春 , 杨书敏 , 张 可 , 杨 红 , 蔺 肖 , 阮坤祥 , 李家奎

(1.华中农业大学动物科学与动物医学学院 , 湖北 武汉430070 ; 2. 普莱柯生物工程股份有限公司 , 河南 洛阳 471000 ;3.襄阳傲农雪生畜牧养殖有限公司 , 湖北 襄阳 441000)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)和猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)感染广泛存在于养猪业中,构成当前危害养猪业发展的重要传染病。猪瘟(Classical swine fever,CSF)亦为所有养殖场必须通过疫苗免疫进行防控的重要病毒性疾病[1-3]。在临床实践中,PCV2和Mhp可共同引发猪呼吸疾病综合征(Porcine respiratory disease syndrome,PRDC),Chen等[4]研究证实,Mhp与PCV2之间存在协同感染关系,Mhp能够加剧PCV2相关性肺脏病变的严重程度,增加PCV2在组织中的病毒载量。大量研究证实,养殖场内PCV2和Mhp的感染严重损害了养殖经济效益,阻碍了畜牧业的健康发展[5-6]。

目前,疫苗免疫是有效控制猪传染病的手段之一。然而,复杂的免疫程序不仅对猪只造成较大的生理应激,同时也增加了养殖工人的负担。因此,在保持疫苗免疫类型不减少的前提下,如何降低免疫次数并仍可达到理想的免疫效果,成为需要深入研究的科学问题。随着养猪场规模化程度的不断扩大和非洲猪瘟感染的持续存在,联合免疫成为当前养猪业的研究热点。为了获得最佳免疫方案,研究人员根据生产实际进行不断地探索。朱巧艳等[7]通过使用圆支二联疫苗作为稀释液稀释猪瘟活疫苗免疫仔猪,发现联合免疫与单独使用圆支二联疫苗免疫的效果相当。陈昌海等[8]通过联合使用猪瘟活疫苗和猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗免疫猪只,发现联合免疫不仅不影响抗体产生,而且能够维持抗体在猪群个体间的稳定分布。翟路峰等[9]使用副猪嗜血杆菌灭活疫苗作为稀释液稀释猪瘟活疫苗免疫仔猪,发现联合免疫组的中和抗体水平与单独免疫组无显著差异,为简化疫苗免疫程序提供了实质性的临床参考依据。车巧林等[10]研究发现,在使用圆环-支原体二联疫苗免疫猪只后,PCV2抗原对猪Mhp免疫产生了增强作用。陈昌海等[11]研究发现,PCV2疫苗和CSF活疫苗的联合免疫不会影响相应抗体的产生,并促进了这2种疫苗抗体在猪群中的稳定分布。综上所述,联合免疫在猪场免疫中具有降低人工成本,提高经济效益的重要意义,且简化了免疫程序。

值得关注的是,目前尚未见到关于将猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗采用联合免疫的方式,在怀孕后期母猪中免疫,并在其所产的仔猪中进行免疫的大规模田间研究报道。本试验将猪圆环病毒2型基因工程疫苗与猪肺炎支原体灭活疫苗混合作为稀释液稀释猪瘟活疫苗,对产前1个月左右的母猪进行免疫,并对其所产仔猪于21日龄时同时免疫这3种疫苗,以母猪单独接受圆-支二联苗和猪瘟活疫苗免疫为对照组,通过监测免疫后临床指标、生产性能和持续性抗体水平,评估联合免疫与传统免疫的实际免疫效果,旨在为优化疫苗免疫程序提供可靠的临床参考依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗 试验疫苗由普莱柯生物工程股份有限公司提供,对照品圆-支二联疫苗购自洛阳惠中生物技术有限公司。疫苗信息见表1。

表1 疫苗信息

1.2 试验设计

1.2.1 试验分组 从襄阳傲农雪生畜牧养殖有限公司选取364 头处于产前1个月的四胎次健康三元母猪,做好耳标,随机分为A组(240 头,联合免疫组:圆柯欣、柯喘宁和稳柯健3种疫苗联合免疫)和B组(124 头,对照组:圆-支二联疫苗和稳柯健疫苗分别免疫)。试验期间猪只的饲养、管理和保健按公司日常管理程序进行。

1.2.2 疫苗免疫方案 试验从母猪产前1个月免疫疫苗开始,到仔猪50日龄时结束,持续77 d。A组(联合免疫组)所有母猪在产前27 d 联合免疫稳柯健、圆柯欣和柯喘宁,母猪生产后,其所产仔猪在21日龄时联合免疫稳柯健、圆柯欣和柯喘宁;B组所有母猪在产前34 d免疫稳柯健,产前27 d免疫圆-支二联疫苗,其所产仔猪在14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。所有仔猪在1日龄进行伪狂犬病活疫苗(普宁)滴鼻免疫并注射保健针,7日龄免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株),35日龄时注射伪狂犬病活疫苗(普宁)(表2)。

表2 疫苗免疫方案

1.2.3 样品采集和指标分析

1.2.3.1 临床指标 观察、记录并统计疫苗免疫后2个组母猪体温、应激(呕吐、发烧、精神沉郁)、采食和哺乳情况,仔猪体温、应激(呕吐、发烧、精神沉郁)、采食和呼吸道疾病发生情况。

1.2.3.2 生产性能 统计分析2个组母猪的窝产健仔数和出生健仔均重,仔猪的日增重和死淘率。

1.2.3.3 持续性抗体水平 采集 A组和B组的母猪和仔猪的血液(表3),静置2～3 h,3 000 r/min离心15 min分离血清,委托第三方专业检测机构洛阳中科基因检测诊断中心有限公司,对免疫后猪只抗体进行检测,并出具检测报告。用阻断率(Percentage inhibition,PI)值表示CSFV抗体阳性率,样品光密度(Optical density,OD)值与阳性对照品OD值的比值(Sample/Positive,S/P)表示PCV2抗体水平。

表3 血液样本采集时间和数量

1.3 数据分析 使用SPSS 26.0软件中的单因素ANOVA检验对各组的ELISA检测结果平均值进行差异显著性比较。用Excel进行作图,数据结果以“平均值±标准差(Mean±SD)”方式表示。

2 结果

2.1 临床指标分析 免疫后2个组母猪采食和哺乳情况均正常,未出现免疫应激和其他严重副反应,所有猪只体温均正常。免疫疫苗后,除A组有1头仔猪出现昏厥,B组有5 头仔猪出现轻微呕吐情况外,其他仔猪均未出现严重的免疫应激情况,且出现免疫应激的仔猪在紧急采取冷水冲头后,症状很快得到缓解;在试验期间内,2个组仔猪免疫后整体精神状态良好,采食情况正常,体温正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。

2.2 生产性能分析 结果如表4所示,A组和B组母猪的窝产健仔数、出生健仔均重分别是12.29头/窝、1.37 kg/头和12.32头/窝、1.38 kg/头,基本一致;A组和B组仔猪出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%。

表4 各组母猪和仔猪的生产性能

2.3 母猪CSFV抗体阳性率检测 结果如表5和图1所示,A组和B组母猪在产前免疫猪瘟活疫苗,2个组母猪的CSFV抗体阳性率在生产当天(0 d)、生产第14 天(14 d)、生产第21 天(21 d)和生产第35 天(35 d)均无明显差异(P>0.05),且均高于70%,远高于保护标准>40%[12];2个组母猪的整体免疫保护率均在90%以上,且无明显差异(P>0.05),说明该猪瘟活疫苗免疫原性很好,均能刺激猪只产生合格的中和抗体;SD值表示标准差,体现的是群体内个体间抗体效价的差异程度,2个组母猪在免疫后的几次检测中,A组母猪的CSFV抗体SD值均要小于B组。

图1 各组母猪猪瘟病毒抗体阳性率变化趋势

表5 各组母猪猪瘟病毒抗体阳性率和免疫保护率

2.4 母猪PCV2抗体检测 结果如表6和图2所示,在生产当天(0 d)时,A组母猪的PCV2抗体S/P值极显著高于B组(P<0.01);在生产第14 天(14 d)时,A组母猪的PCV2抗体S/P值显著高于B组(P<0.05);在生产第21 天(21 d)和生产第35天(35 d)时,2个组无显著差异(P>0.05);除生产第35天(35 d)外,A组母猪各监测时间点的PCV2抗体SD值均小于B组母猪。

图2 各组母猪圆环病毒2型抗体变化趋势

表6 各组母猪猪圆环病毒2型抗体水平和免疫保护率

2.5 仔猪CSFV抗体检测 结果如表7和图3所示,A组和B组仔猪的CSFV母源抗体阳性率在14日龄均远高于规定标准[12],维持在非常高的水平,且A组仔猪的CSFV母源抗体阳性率显著高于B组(P<0.05);A组和B组仔猪在21、35和50日龄的CSFV抗体阳性率无显著差异(P>0.05),但均高于规定标准[12];A组和B组在整个试验周期中的免疫保护率均达到100%。

图3 各组仔猪猪瘟病毒抗体阳性率变化趋势

表7 各组仔猪猪瘟病毒抗体阳性率和免疫保护率

2.6 仔猪PCV2抗体检测 结果如表8和图4所示,A组和B组仔猪各阶段PCV2抗体S/P值均>0.50,表明仔猪均处于稳定或良好的免疫状态;在整个监测期间,A组仔猪PCV2抗体平均值在14和21日龄均显著高于B组(P<0.05);21日龄时,B组仔猪的PCV2抗体平均值出现明显的下降,疫苗免疫保护率为91.67%(11/12),2个组其他日龄仔猪的抗体免疫保护率均达100%。A组仔猪PCV2抗体水平表现得更为稳定。

图4 各组仔猪圆环病毒2型抗体变化趋势

表8 各组仔猪圆环病毒2型抗体水平和免疫保护率

3 讨论

在本试验中,A组(联合免疫组)与B组(对照组)猪只被分别饲养在两栋独立且相邻的圈舍中,由专职员工进行饲养。同时,试验数据的统计不影响猪场正常的生产经营和管理,养殖过程按照猪场正常的流程化制度进行。在整个试验周期中,猪场未发生烈性传染病和严重消化系统疾病,可最大程度排除其他因素对本次试验结果的干扰。在本试验中,A组(联合免疫组)的仔猪在接受疫苗免疫时总应激次数仅有1次,明显低于B组(对照组)总应激次数5次;2个组母猪的窝产健仔数和出生健仔均重无差异。但在仔猪23日龄断奶时,A组仔猪的死淘率较B组仔猪低0.3%,且A组仔猪断奶均重比B组仔猪多160 g/头,A组仔猪相对于B组仔猪在死淘率和生长速度方面略显优势,这与陈昌海等[11]的试验结果相符。A组仔猪采取联合免疫,1次完成3种疫苗的免疫,而B组仔猪则采取2次免疫,猪只的应激次数较A组大,可能是B组仔猪死淘率增加和生长速度略微降低的原因之一。以每头母猪每年产仔2.5 胎次,每胎产仔猪12头为例,1个万头母猪养殖场,仔猪23日龄断奶死淘率降低0.3%来计算,若采用联合免疫策略,每年可增加存活仔猪约900 头,因此,规模养殖集约化生产中,联合免疫策略具有提高经济效益的潜力。

本试验期间,A组和B组母猪均在产前1个月接受猪瘟活疫苗免疫,2个组母猪的CSFV抗体阳性率无明显差异。值得注意的是,仔猪在14日龄时,A组仔猪的CSFV母源抗体阳性率显著高于B组仔猪,高水平的母源抗体可能预示着更强的免疫保护效力,然而在仔猪21、35和50日龄3个阶段,2个组仔猪的CSFV抗体阳性率并未显示出明显差异,而且猪瘟活疫苗对仔猪的免疫保护率均维持在极高的水平,这说明A组仔猪在21日龄采取联合免疫猪瘟活疫苗,与B组仔猪在28日龄采取的单独免疫猪瘟活疫苗,2种免疫方案对诱导仔猪产生自身CSFV抗体并无明显差别。

张敬峰等[13]等研究发现,猪圆环病毒的感染会对猪的免疫系统造成损害,从而抑制猪瘟活疫苗的免疫应答,而PCV2阳性场,免疫PCV2疫苗能够明显增强CSF活疫苗的免疫效果。研究还发现,猪只从免疫PCV2疫苗到形成自身强大免疫保护所需的时间为14 d[9,10,13],而在仔猪21日龄后,PCV2母源抗体阳性率下降加快,因此建议仔猪在21日龄之前免疫PCV2疫苗[14-16]。在本试验中,A组和B组母猪均在产前27 d免疫PCV2疫苗,均成功诱导了高水平的PCV2抗体。然而,在仔猪14和21日龄时,A组母猪所产仔猪获得的PCV2母源抗体要显著高于B组仔猪,表明A组母猪免疫PCV2疫苗后产生的PCV2抗体显著高于B组。高水平的母源抗体预示着更强的免疫保护,推测是B组仔猪在14日龄免疫PCV2疫苗,高水平的PCV2母源抗体可能干扰了外源性PCV2疫苗在体内的正常增殖所致。但是,在仔猪35和50日龄2个阶段,A组和B组仔猪PCV2抗体均维持在良好的抗体保护水平,且两组无显著差异,表明针对该PCV2疫苗,联合免疫与单独免疫对诱导猪只产生高水平的PCV2抗体保护效果是相似的。这一发现与车巧林等[10]和陈昌海等[11]研究结论一致。同时本试验也发现,母猪在产前27 d免疫PCV2疫苗,仔猪在21日龄免疫PCV2疫苗是合理且可行的,与相关研究结论一致[17-18]。

大量研究证实,在仔猪7～21日龄期间进行猪肺炎支原体疫苗免疫,能够有效控制猪只在早期感染支原体肺炎,进而提升生产性能[19]。Takeuti等[20]研究发现,对母猪定期免疫支原体疫苗可降低猪群的感染压力,减少向环境排放细菌的数量,从而降低对仔猪的感染风险。Wallgren等[21]和Arsenakis等[22]研究表明,在母猪妊娠后期(至少在产前4周)免疫支原体疫苗,有助于减少仔猪断奶时猪肺炎支原体的定殖,显著减少由支原体引起的仔猪呼吸道疾病。由于猪肺炎支原体的免疫逃逸和滞后的血清学反应特性,通常在感染后3～8 周才能检测到猪肺炎支原体的特异性抗体[23]。研究发现,支原体肺炎感染主要局限于呼吸道,很少进入血液和淋巴循环系统,即使机体产生了抗体,体液中的高水平抗体也无法直接与病原体发生中和作用[24]。因此,目前市场上售卖的多款针对猪肺炎支原体的抗体检测试剂盒无法区分母源抗体和疫苗抗体[1],猪肺炎支原体抗体检测试剂盒基本上不作为猪场支原体肺炎疫苗保护的评估标准。在本次试验中,尽管未进行支原体抗体水平的相关监测,但通过对猪只咳嗽和气喘等呼吸道症状的观察,发现在整个试验期间,2个组仔猪在呼吸道疾病方面均未出现异常情况。

综上所述,本试验对母猪及所产仔猪进行CSFV和PCV2抗体检测,结合仔猪临床呼吸道症状观察,发现猪瘟活疫苗(稳柯健)、猪圆环病毒2型基因工程疫苗(圆柯欣)和猪肺炎支原体灭活疫苗(柯喘宁)这3种疫苗可以采取联合免疫方案,彼此之间并不产生干扰。鉴于非洲猪瘟大环境和规模养殖集约化趋势下,本试验在猪场原有免疫基础上进一步优化猪群免疫程序,在不影响规模化养殖场的正常生产运营前提下,进行了大规模的田间研究,取得了良好的效果。本试验通过简化免疫程序,降低猪只与人和物的接触,减低感染风险,这对于提高猪场的生产效益具有切实的现实意义。