云南省部分地方品种鸡禽白血病病毒感染情况调查及南涧乌骨鸡种鸡禽白血病净化效果评估

严红亚 , 陈 月,2 , 王国君,2 , 李 珂 , 赵 博 , 元正菊 , 张 刚 , 信爱国 , 赵 蓉

(1.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所 , 云南 昆明 650224 ; 2.云南农业大学动物医学院 , 云南 昆明 650201 ; 3. 云南绿盛美地畜牧科技有限公司 , 云南 宜良 652100)

禽白血病(Avian leucosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leucosis virus,ALV)引起的一种肿瘤性疾病。能导致鸡群发病的主要是外源性ALV,包括A～D、J亚群和新发现的K亚群[1-2],ALV可造成鸡群生长发育迟缓,成活率、产蛋率、受精率和孵化率等生产性能降低,同时可导致被感染鸡的免疫抑制,引发疾病[3-4]。AL属于垂直传播性疾病,亦可通过水平传播,目前尚无有效的疫苗和治疗方法,加强种鸡核心群外源性ALV净化和淘汰病鸡是防控AL最有效的方法[5-6]。在我国,几乎所有商品鸡和地方品种鸡都存在ALV感染,个别地方品种鸡的ALV感染甚至已威胁到种质资源的保护[7],因此,在原种场和保种场开展AL疫病净化工作势在必行。

云南省拥有丰富的家禽遗传资源,优质地方鸡品种较多。然而,由于养殖条件和养殖水平相对落后,云南省地方品种鸡ALV 感染情况严重[8]。本试验对云南省部分地方品种鸡开展ALV感染情况调查,了解ALV在不同鸡群的感染情况,选择在南涧乌骨鸡种鸡场开展了3个世代的AL净化工作并评估净化效果,为云南省地方品种鸡AL净化和防控提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

1.1.1 普查样品采集 于2019—2021年从云南省滇东(文山、昭通)、滇南(绿春)、滇中(昆明、楚雄)、滇西(大理)和滇北(丽江、迪庆)5 个地区选取12种地方品种鸡,翅静脉无菌采集血浆,分离血清,进行禽白血病病毒J亚群(ALV-J)抗体和ALV p27抗原检测。所有种鸡场均未进行过AL净化,散养或笼养且同一只母禽所产全同胞均未同袋孵化。采样时,参考云南省ALV感染情况调查报告[9]和本实验室前期对云南省部分地方品种鸡血清样本ALV-J抗体抽样调查结果,采用估计流行率方法进行采样,置信水平为90%,可接受误差为5%,预期流行率为50%,对照统计学的大群体估计患病率样品抽样表[10],确定最少抽样样品数为68份。3年期间在各原种鸡场采取随机抽样方式,共无菌采集血清1 707份、血浆1 614份,其中公鸡血清和血浆样本共1 327份,母鸡血清和血浆样本共1 994份。样品采集详细信息见表1。

表1 普查样品信息

1.1.2 南涧乌骨鸡种鸡场样品采集 于2020—2022年对1.1.1中滇西南涧乌骨鸡种鸡场进行连续3个世代AL净化,无菌采集各世代种鸡血浆、蛋清和精液样本,-80 ℃保存。样品数量信息见表2。

表2 南涧乌骨鸡种鸡场采集样品信息

1.2 主要试剂 ALV-J抗体检测试剂盒(产品批号:DR283)和ALV p27抗原检测试剂盒(产品批号:DS919),均购自美国IDEXX公司;胎牛血清和0.25%胰酶,均购自GIBCO公司;DMEM高糖培养基,购自武汉塞维尔生物科技有限公司;鸡胚胎成纤维细胞系(Douglas foster-1,DF-1)由本实验室传代保存。

1.3 主要耗材和仪器 普通真空采血管和肝素钠真空采血管,江西众杰医疗器械有限公司产品;低速离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司产品;CO2恒温培养箱和酶标读板仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司产品;微量移液器,Eppendorf 公司产品。

1.4 样品处理和检测方法

1.4.1 血清样品处理 普通真空采血管翅静脉采血约3 mL,室温静置沉淀,1 000 r/min离心5 min,分离血清,进行ALV-J抗体检测。

1.4.2 血浆样品处理 肝素钠真空采血管翅静脉采血约3 mL,室温静置沉淀,1 000 r/min离心5 min,取100 μL血浆接种于48孔板中的DF-1细胞,37 ℃、5% CO2培养箱作用2 h,PBS润洗1遍,加入含1%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃、5% CO2培养箱培养8 d,-20 ℃反复冻融3次,取细胞上清进行ALV p27抗原检测。

1.4.3 蛋清样品处理 每只母鸡收集3枚初产蛋,每枚初产蛋各吸取500 μL蛋清于2 mL灭菌离心管中混匀,-20 ℃反复冻融3次,进行ALV p27抗原检测。

1.4.4 精液样品处理 每只种公鸡采集精液2 mL于灭菌离心管中,将精液按1∶6在含青霉素和链霉素的DMEM培养基中稀释,10 000 r/min离心10 min,取上清进行ALV p27抗原检测。

1.4.5 检测方法 将处理好的血清样本按照ALV-J抗体检测试剂盒说明书进行检测,将处理好的血浆、蛋清和精液样本按ALV p27抗原检测试剂盒说明书进行检测。

1.5 净化方案 在本实验室前期对云南省部分地方品种鸡ALV感染情况调查结果以及地方品种鸡带毒和排毒研究[11]的基础上,结合南涧种鸡场的实际饲养管理情况和经济状况,最终确定适用于该鸡场的AL净化方案。

建立核心种群饲养区,完善保种场基础设施,生物安全和生产管理等方面严格按照兽医卫生防疫要求进行。核心种群使用独立的孵化车间,设置专门的育雏笼、育成笼和产蛋笼。阳性鸡淘汰后,应用2种以上消毒剂对笼位进行彻底清洗消毒,对所要用到的场所和用具提前进行清洁消毒,饲养员每次进出栏舍严格消毒,阻断一切可能造成水平传播的途径。

种蛋逐枚编号,同一只母禽所产全同胞均同袋孵化,检出ALV阳性则淘汰种鸡及其所有后代。育雏后期6周龄,采集鸡群血浆,同1.4.2分离血浆病毒并检测ALV p27抗原,淘汰阳性鸡;开产前23周龄,采集母鸡初产蛋蛋清和公鸡精液,同1.4.3和1.4.4检测ALV p27抗原,淘汰阳性鸡;纯繁前40周龄,采集鸡群血浆,同1.4.2分离血浆病毒并检测ALV p27抗原,淘汰阳性鸡,其后每个世代的培育均依此程序循环,本试验共进行了3个世代净化。

1.6 生产性能和繁殖性能评估 采用同样的采样日龄和检测方法,记录各世代商品鸡育雏期前7 天病死数、出栏日龄、饲料用量和药品金额,测定出栏体重,计算前7天死淘率、成活上市率、平均每只鸡出栏体重、药用成本和料肉比。记录开产后21～43周龄每只母鸡每天的产蛋数,统计161 d内总产蛋数并计算平均产蛋数和产蛋率;种群孵化时登记入孵蛋总数,7 d后照蛋并记录未受精蛋和死精蛋,21 d出壳后记录死雏和健雏数,计算受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率和健雏率。

1.7 数据分析 试验结果按照试剂盒说明书进行判定。运用Excel对地方品种鸡不同地区、不同品种、不用性别和不同养殖方式ALV-J抗体和ALV p27抗原阳性率、1～3世代商品肉鸡生产性能和繁殖性能数据进行整理分析,运用SPSS 19.0软件对南涧乌骨鸡种鸡场3个世代ALV p27抗原净化数据进行卡方(χ2)检验,运用GraphPad Prism 8.0.2软件作图,P<0.05定义为统计学差异显著,P<0.01定义为统计学差异极显著。

2 结果

2.1 云南省部分地方品种鸡ALV感染状况分析

2.1.1 不同地区分析 检测结果见表3,云南省5个地区的1 707份血清样本经ALV-J抗体检测皆存在不同水平的ALV感染,不同地区鸡群ALV-J抗体阳性率差异明显,其中滇南地区ALV-J抗体群体阳性率最高,达65.00%,滇北地区ALV-J抗体群体阳性率最低,为32.91%;5个地区的1 614 份血浆样本经ALV p27抗原检测,滇西地区群体阳性率最高,为25.71%,滇东地区群体阳性率最低,为12.04%,滇南地区未检出;各地区ALV群体总平均阳性率为29.87%。结果表明,云南省不同地区地方品种鸡均存在ALV感染。

表3 云南省不同地区地方品种鸡ALV阳性率

2.1.2 不同品种和不同性别分析 对不同品种地方鸡采集的血清和血浆样品进行ALV-J抗体检测和ALV p27抗原检测,结果如表4所示,云南省部分地方品种鸡ALV-J抗体和ALV p27抗原检测群体阳性率为29.87%,其中绿春黄连鸡ALV阳性率最高,达65.00%;石林土鸡和玉溪土鸡2个地方品种鸡呈现ALV-J抗体和ALV p27抗原阴性,可能是检测样本数量太少、检测日龄太小等原因,并不说明鸡群没有感染ALV。在采集的样品中,公鸡样本1 327份,ALV-J抗体和ALV p27抗原群体阳性率为30.52%;母鸡样本1 994份,ALV-J抗体和ALV p27抗原群体阳性率为29.44%,公鸡群体阳性率高于母鸡群体阳性率。结果表明,云南省各地方品种鸡ALV-J抗体和ALV p27抗原阳性率差异明显,且公鸡ALV群体阳性率高于母鸡。

表4 不同品种和不同性别地方品种鸡ALV阳性率

2.1.3 不同养殖方式分析 共检测种鸡场血清样品1 026份,散养户血清样品681份,检测结果见表5,种鸡场ALV-J抗体群体阳性率为42.88%,散养户ALV-J抗体群体阳性率为47.72%,散养户ALV-J抗体群体阳性率高于种鸡场。

表5 不同养殖方式地方品种鸡ALV-J抗体阳性率

2.2 南涧乌骨鸡种鸡场3个世代AL净化效果

2.2.1 南涧乌骨鸡种鸡场AL净化趋势 南涧乌骨鸡种鸡场AL净化进程和净化效果见表6和图1,种鸡场经过2020—2022年3个世代的检测净化,血浆、蛋清和精液样本ALV p27 抗原阳性率均明显下降;精液样本ALV p27抗原阳性率由1世代的58.33%极显著下降到3世代的16.87%(χ2=503.87,P<0.01);蛋清样本ALV p27抗原阳性率由1世代33.71%极显著下降到3世代的14.56%(χ2=151.22,P<0.01);40周龄公鸡血浆样本ALV p27抗原阳性率由1世代的22.54%极显著下降到3世代的0.85%(χ2=199.549,P<0.01);40周龄母鸡血浆样本ALV p27抗原阳性率由1世代的18.71%极显著下降到3世代的0.66%(χ2=254.65,P<0.01)。

图1 南涧乌骨鸡种鸡场3个世代鸡群ALV p27抗原阳性率

表6 南涧乌骨鸡种鸡场AL净化过程中ALV p27抗原阳性率

2.2.2 种鸡AL净化对商品鸡生产性能的影响 如表7所示,随着AL净化实施,商品鸡生产性能各指标均明显提升,与净化初期原鸡群(1世代)相比,3世代商品鸡群前7 天死淘率下降了3.3%,出栏日龄提前了19 d,成活上市率提高了5.1%,商品公鸡平均每只鸡出栏体重增重了0.49 kg,商品母鸡平均每只鸡出栏体重增重了0.34 kg,平均每只鸡药用成本降低了0.26元,生产1 kg毛鸡饲料耗用量下降0.8 kg。

表7 1～3世代商品鸡生产性能

2.2.3 种鸡AL净化对种鸡繁殖性能的影响 如表8所示,随着AL净化实施,种鸡繁殖性能各指标均明显提升,与净化初期原鸡群(1世代)相比,3世代种鸡开产后21～43周共161 d内平均每只鸡多产蛋29.8枚,产蛋率提高了11.30%,受精率提升了5.02%,受精蛋孵化率提升了8.35%,入孵蛋孵化率提升了12.00%,健雏率提升了12.21%。经过3个世代的净化,南涧乌骨鸡种鸡育雏期、育成期和产蛋期死亡率相比1世代明显下降,产蛋性能显著提高,种蛋品质和产蛋数量进一步提高,南涧种鸡场经济效益增长显著。

表8 1～3世代种鸡繁殖性能

3 讨论

3.1 云南部分地方品种鸡感染状况调查 近年来,地方品种鸡群中AL的发病率逐渐上升,且混合感染情况愈发严重,宿主范围也在不断扩大,给种鸡场造成严重的经济损失。俞燕[12]对全国26种地方品种鸡进行AL流行病学调查,发现有22种地方品种鸡ALV-J抗体呈阳性,各品种鸡群对ALV均易感。本试验对2019—2021年云南省部分地方品种鸡ALV-J抗体和ALV p27抗原检测发现,云南省ALV净化形势严峻,种鸡场和散养户均存在不同程度的ALV感染,云南省5个地区12种地方品种鸡ALV-J抗体群体阳性率为44.82%,与张倩[13]于2011—2016 年对全国19个省、市、自治区的60个祖代场调查的ALV-J抗体群体阳性率(26.3%～64.71%)相近,高于赵胜杰等[14]于2021年调查的河南省39个规模鸡场的ALV-J抗体群体阳性率(10.40%)。结果表明,云南省部分地方品种鸡ALV感染情况严重,对种鸡场开展AL监测和净化,对AL防控具有重要意义。

本试验通过对云南省12种地方品种鸡进行ALV-J抗体和ALV p27抗原阳性率调查,发现不同地方品种鸡ALV-J抗体和ALV p27抗原群体阳性率为29.87%,低于白马伟等[9]调查的云南省昆明地区规模化种鸡场ALV-J抗体群体阳性率(62.68%)。陈海燕[15]对郑州市地方鸡群和蛋鸡群进行 ALV p27抗原检测,总阳性率分别为 16.4%和16.6%,与本试验中不同地区地方品种鸡ALV p27抗原阳性率为14.06%调查结果相近。这些结果表明,我国不同地方品种鸡群普遍存在ALV感染,且不同品种间感染情况存在一定差异,部分种鸡场未开展AL监测和净化工作。本试验根据不同品种和不同性别调查发现,不同品种鸡群中公鸡ALV-J抗体和ALV p27抗原群体阳性率(30.52%)高于母鸡(29.44%),与白马伟等[9]调查的云南省昆明地区规模化种鸡场公鸡泄殖腔ALV-J抗体群体阳性率(80.75%)高于母鸡蛋清ALV-J抗体群体阳性率(37.39%)的结果一致。本试验根据不同养殖方式的调查发现,云南省种鸡场ALV-J抗体群体阳性率(42.88%)和散养户ALV-J抗体群体阳性率(47.72%)明显高于卢海英[16]报道的种鸡场AL群体阳性率(7.86%)和散养户AL群体阳性率(14.83%),由于遗传背景、养殖条件、饲养管理模式、免疫程序和专业技术等诸多因素,散养户鸡群感染风险大于养殖场鸡群,故散养户鸡群AL感染率更高,同时表明云南省部分地方品种鸡ALV感染更加普遍,防疫工作不到位,垂直和水平传播严重,养殖场/户长期未对ALV的检测和净化足够重视。

3.2 南涧乌骨鸡种鸡AL示范性净化效果 目前尚无切实可行的AL控制方法,种鸡场疫病净化是控制病毒传播的有效方法[17]。AL的净化需要通过了解待净化鸡群ALV的感染情况、父母代鸡和商品代鸡的感染和发病情况以及ALV的排毒规律,然后根据种鸡场经济状况和饲养管理模式进行综合分析,制定适宜的净化方案,才能提高阳性检出率,缩短净化时间,降低净化成本。由于不同鸡群之间存在差异,因此净化方案不是一成不变的,不能仅仅通过单次检测就完全淘汰所有感染ALV的鸡群[18-19]。王培坤等[20]经过6 个世代的净化,三黄鸡育种三系配套系群体ALV p27 抗原阳性率下降明显。胡杰等[21]在广西11 家重点种鸡场经过8年的净化,鸡群ALV总平均阳性率从12.16%下降到0.30%。晏志勋等[22]对北京油鸡开展AL净化,结果显示,蛋清、公鸡精液、肛拭和雏鸡胎粪的p27抗原阳性率均显著下降。本试验结合多种检测方法,通过3个世代检测淘汰阳性个体制定适合南涧种鸡场的净化方案,经过3个世代的净化,蛋清、精液、公鸡血浆和母鸡血浆样本的ALV p27 抗原阳性率都极显著下降。虽然下降幅度与文献报道[20-21]存在差异,但这主要是由于统计鸡群数量、品种和净化世代的差异所致。该种鸡场还将继续进行多个世代的AL净化工作,以进一步降低ALV感染率。

ALV感染会对鸡群增重、产蛋性能和繁殖性能造成不利影响[23]。本试验南涧乌骨鸡种鸡经过3个世代AL净化后,从生产性能看,3世代商品鸡群前7天死淘率、药用成本和料肉比明显下降,同时出栏日龄提前了19 d,成活上市率和平均每只鸡出栏体重均明显提高;从繁殖性能看,161 d内平均每只种鸡产蛋数、产蛋率、受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率和健雏率都明显提高,说明AL净化对提高鸡场实际生产和经济效益有显著的作用。这与胡杰[21]和常枨等[23]提到的养鸡场实施AL净化后净收益有了明显提升的研究结果一致。进一步证明本试验中针对南涧乌骨鸡种鸡制定的ALV检测技术和AL净化方案切实可行,成效显著。

本试验调查结果显示,云南省部分地方品种鸡中普遍存在ALV感染,并且情况复杂。自繁自养的地方品种鸡群中,大部分鸡群未进行AL监测和净化工作,由于水平传播和垂直传播等原因,地方品种鸡的ALV感染率呈上升趋势。针对云南省部分地方品种鸡群中ALV感染严重的问题,应该继续研究不同地方品种鸡群的带毒和排毒情况以及ALV的遗传变异特点,制定适合地方品种鸡群的净化方案,以降低ALV对地方品种鸡群的威胁,最终实现疫病净化。本试验提供的净化方案对云南省地方品种鸡AL的净化起到一定的指导作用,可进一步在其他鸡群推广应用,加快云南省地方品种鸡AL净化,保护丰富的地方种质资源。