栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响

吴佳 吴进 肖凯 凌超

摘要 目的：觀察栀子苷对载脂蛋白E缺乏（ApoE-/-）小鼠Th17/调节性T（Treg）细胞失衡的影响及其作用机制。方法：将50只纯合子ApoE-/-雌性小鼠随机分为对照组、模型组和栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组。对照组小鼠喂养普通饲料，模型组和栀子苷组小鼠喂养高脂饲料。从第8周开始，栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷（25、50、100 mg/kg），连续8周。试验结束时，采用油红O染色评估主动脉及其根部动脉粥样硬化（AS）病变面积比。采用定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析主动脉组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-17A和IL-10 mRNA表达；采用流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg细胞百分比；蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测主动脉组织磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关蛋白表达。结果：油红O染色病变显示，栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组（P＜0.05）。与对照组比较，模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高（P＜0.05）；栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低（P＜0.05）。与对照组比较，模型组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低（P＜0.05）；栀子苷各剂量组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平升高（P＜0.05）。与对照组比较，模型组小鼠脾脏中Th17细胞百分比升高，Treg细胞百分比降低（P＜0.05）。栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。栀子苷抑制PI3K的表达及AKT和mTOR的磷酸化，MHY1485（mTOR活化剂）减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。结论：栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多和Th17细胞减少有关。

关键词 动脉粥样硬化；栀子苷；载脂蛋白E缺乏；Th17/调节性T细胞；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路；小鼠；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.05.008

Effect of Geniposide Regulating PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway on Th17/Treg Function during Atherogenesis

WU Jia， WU Jin， XIAO Kai， LING Chao

Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital， Changsha 410008， Hunan， China

Corresponding Author WU Jin， E-mail： wujinwujin@163.com

Abstract Objective：To observe the effect of Geniposide on Th17/ regulatory T（Treg） cell imbalance in apolipoprotein E deficient（ApoE-/-） mice and its mechanism.Methods：Fifty female homozygous ApoE-/- mice were randomly divided into control group，model group，geniposide low-dose group，geniposide medium-dose group and geniposide high-dose group.From the 8th week，each dose group was given daily gavage of geniposide（25，50，100 mg/kg） for 8 weeks respectively.At the end of the experiment，the lesion area ratio of atherosclerosis（AS） in the aorta and its roots was assessed by oil red O staining.Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR） was used to detect the mRNA expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6），IL-17A and IL-10 in aortic tissue.The percentage of Th17 and Treg cells in spleen was analyzed by flow cytometry.Western Blot was used to detect phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin（mTOR） signals in aortic tissue.Results：Oil red O staining showed that pathological percentage in the geniposide medium-dose group and geniposide high-dose group was lower than that in the model group（P＜0.05）.Compared with the control group，the mRNA expressions of TNF-α，IL-6，and IL-17A in aorta of the model group increased（P＜0.05），and the mRNA expressions of TNF-α，IL-6 ，and IL-17A in aorta of geniposide dose groups decreased（P＜0.05）.Compared with the control group，the percentage of Th17 cells increased and the percentage of Treg cells decreased in the spleens of the model group（P＜0.05）.Geniposide restored the balance of Th17 and Treg cells in AS mice.Geniposide inhibited the expression of PI3K and the phosphorylation of AKT and mTOR，and MHY1485（mTOR activator） attenuated the effect of geniposide on T cell differentiation.Conclusion：The mechanism of anti-AS action of geniposide might be related to the increase of Treg cells and the decrease of Th17 cells induced by inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.

Keywords atherogenesis; Geniposide; apolipoprotein E deficient; Th17/ regulatory T cell; phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin（mTOR） signaling pathway; mice; experimental study

基金项目 湖南省卫生健康委科研项目（No.20200083）

作者单位 湖南省妇幼保健院（长沙  410008）

通讯作者 吴进，E-mail：wujinwujin@163.com

引用信息 吴佳，吴进，肖凯，等.栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（5）：817-822.

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种由先天性和适应性免疫反应及白细胞浸润引起的进行性慢性炎症性疾病［1-2］。相关研究表明，Th17和CD4＋CD25＋调节性T（Treg）细胞的平衡在炎症和自身免疫性疾病的发展中十分重要［3］。在AS动物模型和急性冠脉综合征病人的局部AS病变和循环淋巴细胞中发现Th17细胞反应性上调，且Treg细胞/Th17细胞失衡与AS

发展、斑块破裂有关［4-5］。栀子苷（Geniposide）是从栀子中分离得到的一种环烯醚萜苷化合物，具有广泛的抗炎和抗氧化作用［6］。有研究显示，栀子苷可抑制巨噬细胞中炎症介质释放［7］。目前，关于栀子苷的抗炎作用是否有助于改善AS中的Th17/Treg细胞失衡尚未明确。本研究观察栀子苷对载脂蛋白E缺乏（apolipoprotein-E deficient，ApoE-/-）小鼠Th17/Treg细胞失衡的影响及其作用机制，旨在为栀子苷防治AS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50只7周龄纯合子ApoE-/-雌性小鼠购自南京大学模式动物遗传研究中心。将小鼠饲养在聚碳酸酯笼中，每笼5只，在无病原体温度（25 ℃）环境中进行严格的12 h光照/黑暗循环饲养，自由进食、饮水。将小鼠随机分为对照组、模型组、栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组，每组10只。对照组小鼠喂养普通饲料，模型组和栀子苷各剂量组小鼠喂养高脂饲料（18%脂肪和1.2%胆固醇）。从第8周开始，栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷（25、50、100 mg/kg），连续8周。对照组、模型组给予等量生理盐水灌胃。第16周，使用0.5%戊巴比妥钠（美国Sigma公司）腹膜内麻醉小鼠。通过心脏穿刺收集血液，解剖并保存主动脉和脾脏组织以备进一步研究。

1.2 主动脉粥样斑块分析

将主动脉及其根部在磷酸缓冲盐溶液（PBS）、4%甲醛、30%蔗糖中固定过夜，之后将其固定在OCT包埋剂（美国Sakura公司）中并在－70 ℃下冷冻。将冷冻切片（10 mm）用油红O染色。从每只小鼠的5个切片中分别获取病变面积百分比以定量分析AS情況。采用Olympus BX51成像系统（日本Olympus公司）捕获切片图像，使用Image-Pro Plus 6.0测量斑块面积。

1.3 血脂与脂蛋白谱分析

采用7060型自动分析仪（日本日立公司）酶法测定血清血脂［三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）］和脂蛋白谱。

1.4 定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析

使用TRIzol试剂（日本TaKaRa公司）从小鼠主动脉组织中提取总RNA。使用RNA PCR试剂盒（日本Takara Biotechnology公司）将1 μg总RNA反转录为cDNA，并将cDNA作为模板，使用StepOnePlus实时荧光定量PCR系统（美国Applied Biosystems公司）进行实时PCR。管家基因磷酸苷油酸脱氢酶（GAPDH）作为PCR的内部对照。PCR反应混合物使用SYBR Green I（日本Takara Biotechnology公司）、cDNA和引物。使用常规2－△△Ct方法计算目的基因的表达。引物序列：肿瘤坏死因子-α（TNF-α），正向引物5′-CGCCTCACCTGACCTACC-3′，反向引物5′-TTGCCTCGTTCTGGACTATAC-3′；白细胞介素（IL）-6，正向引物5′-CACCTATGCCACCCTTATCC-3′，反向引物5′-CGAACATGCGAGTAAACCAA-3′；IL-17A，正向引物5′-GCTGACCCCTAAGAAACCCC-3′，反向引物5′-GAAGCAGTTTGGGACCCCTT-3′；IL-10，正向引物5′-ATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG-3′，反向引物5′-CCCAAGTAACCCTTAAAGTCCTGC-3′；GAPDH，正向引物5′-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3′，反向引物5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′。

1.5 细胞制备与流式细胞仪

参照文献［8］中方法制备脾细胞悬液。使用无菌针在冷的PBS中挤压小鼠新鲜脾脏，使其通过70 μm的细胞过滤器，制备单个核细胞悬液。通过Ficoll-Hypaque分离脾淋巴细胞，并重悬于完全培养基：RPMI-1640（美国Gibco公司）中，使用台盼蓝染色检测的细胞存活率＞95%。采用流式细胞仪分析Th17和Treg细胞。将细胞等分至试管中，并在PBS中洗涤1次，之后重悬至106个细胞/mL。使用异硫氰酸荧光素（FITC）结合CD4（1∶200）或PE结合CD4（1∶200）在4 ℃下持续孵育20 min。通过细胞内固定和渗透试剂盒在细胞内用PE-cy7-结合的IL-17A（1∶100）进行细胞内染色或使用叉头框蛋白p3（Foxp3）/转录因子染色缓冲试剂盒在核内用PE-cy7-结合的Foxp3（1∶100）（抗体和试剂盒均购自美国eBioscience公司）进行染色。给予同型对照以实现正确的补偿并确认抗体特异性。在BD-FACS-Calibur流式细胞仪（美国BD-Biosciences公司）进行流式细胞术分析。使用Flow Jo软件（美国Ashland公司）分析数据。

为了分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）对Treg细胞的影响，将脾脏单个核细胞培养于RPMI 1640完全培养基中，用抗CD3、抗CD28抗体（1 μg、1×106个/细胞）刺激，加用或不加用栀子苷（5 μmol/L）和MHY1485（mTOR活化剂，2 μmol/L）处理72 h。使用流式细胞仪对细胞样品中Th17和Treg细胞进行定量测定。

1.6 蛋白免疫印迹法（Western Blot）分析

采用RIPA缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）裂解主动脉组织标本提取总蛋白。通过二喹啉甲酸（BCA）试剂盒评估蛋白质含量。采用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（美国Invitrogen公司）。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，之后在4 ℃条件下，以一抗封闭过夜：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）（1∶1 000）、蛋白激酶B（AKT，1∶1000）、磷酸化AKT（p-AKT，1∶1000）、mTOR（1∶1500）、磷酸化mTOR（p-mTOR，1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），均购自英国Abcam公司。将PVDF膜与二抗在室温下孵育1 h。使用蛋白免疫印迹法检测化学发光试剂盒观察目标条带。

1.7 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用双尾t检验或单因素方差分析和Bonferroni-Dunn事后检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 栀子苷对ApoE-/-小鼠AS发展的影响

与对照组比较，模型组和栀子苷各剂量组实验结束后TC和LDL-C升高（P＜0.05）。详见表1。对整个主动脉的油红O染色病变量化结果显示，栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组（P＜0.05）。详见图1A、图1B。测量主动脉根部的横截面积时，栀子苷治疗以剂量依赖的方式降低了病变百分比（P＜0.05）。详见图1C、图1D。

2.2 栀子苷调节TNF-α、IL-6和IL-17A、IL-10 mRNA及Th17和Treg细胞的平衡

与对照组比较，模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高；与模型组比较，栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低，且栀子苷组呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组主动脉中抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低；与模型组比较，栀子苷各剂量组主动脉IL-10 mRNA表达水平升高，且栀子苷组呈剂量依赖性升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图2A。进一步行流式细胞术分析结果显示，与对照组比较，模型组脾脏中CD4＋IL-17A＋细胞百分比升高，CD4＋Foxp3＋细胞百分比降低；与模型组比较，栀子苷各剂量组脾脏中CD4＋IL-17A＋细胞百分比降低，CD4＋Foxp3＋细胞百分比升高，且栀子苷组呈剂量依赖性变化，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图2B～图2D。

2.3 栀子苷抑制PI3K/AKT/mTOR信号的激活

與模型组比较，栀子苷各剂量组主动脉PI3K表达及AKT和mTOR的磷酸化表达水平降低，且栀子苷各组呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图3A、图3B。当用MHY1485（mTOR活化剂）/栀子苷/MHY1485＋栀子苷处理从ApoE-/-小鼠脾脏分离的单核细胞，结果显示，与对照组比较，MHY组CD4＋IL-17A＋细胞百分比增加，CD4＋Foxp3＋细胞百分比降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与MHY组相比，栀子苷组CD4＋IL-17A＋细胞百分比显著降低，CD4＋Foxp3＋细胞百分比增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与栀子苷组比较，栀子苷＋MHY组CD4＋IL-17A＋细胞百分比增加，CD4＋Foxp3＋细胞的百分比降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图4～图6。

3 讨 论

AS是一种慢性炎症性疾病，在病变形成过程中，免疫细胞发挥着重要作用［9-11］。CD4＋T细胞被认为是最早进入人类病变的免疫细胞之一［12］。严重免疫缺陷突变（SCID）小鼠与ApoE-/-小鼠杂交时由于缺乏成熟的T细胞和B细胞，其后代AS斑块减少［13］。将CD4＋T细胞转移到ApoE-/-的SCID小鼠体内可加重AS发展［14］。近年来，多种抗炎治疗AS的方法被研发出来，证实是有效的［15］。CANTOS研究显示，IL-1β的单克隆抗体（canakinumab）可降低复发性心血管事件发生率，降低与血脂水平无关［16］。本研究结果显示，ApoE-/-小鼠AS发展是Th17/Treg失衡的结果；与对照组比较，模型组小鼠Th17细胞百分比和IL-17A、IL-6和TNF-α mRNA水平明显升高。有研究表明，Th17细胞在AS形成中发挥着重要作用，不稳定型心绞痛和急性心肌梗死病人血浆IL-17A升高［17］。IL-17A可诱导巨噬细胞产生基质金属蛋白酶（MMP）-9，与易损斑块有关［18］。相关研究显示，在高脂血症小鼠模型和人类研究中，Th17细胞和Tregs与AS进展呈负相关［4］。本研究结果显示，模型组小鼠Treg细胞及IL-10水平降低。因此，在高脂血症ApoE-/-小鼠AS形成过程中存在Th17/Treg功能失衡，其可能在AS斑块负荷和稳定性中发挥作用。

栀子苷是从栀子中提取的环烯醚萜苷，是栀子中的主要活性成分。有研究表明，栀子苷可降低TNF-α、IL-1、IL-6和IL-1β含量，具有显著的抗AS作用［19］。相关研究显示，栀子苷对炎症反应的抑制作用涉及丝裂原活化蛋白激酶途径的抑制［20］。本研究结果显示，栀子苷以剂量依赖方式减弱了喂饲高脂饲料的ApoE-/-小鼠体内AS病变发展，且栀子苷处理显著降低了ApoE-/-小鼠主动脉中促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-17A）水平，提高了抗炎细胞因子IL-10水平，提示栀子苷可能通过降低IL-17A和提高IL-10在主动脉中的表达抑制AS发展。IL-17A/IL-10主要由Th17和Treg细胞产生，这两种类型的T细胞可能受到栀子苷影响；进一步流式细胞术分析结果显示，栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。上述结果表明栀子苷改善AS发展的机制可能与Th17和Treg细胞的调节有关。

栀子苷如何调节T细胞分化尚未明确。相关研究发现，mTOR在启动效应CD4＋T细胞分化中发挥重要作用，缺乏mTOR的T细胞未分化为Th1、Th2或Th17效应细胞，而是分化为Foxp3＋调节性T细胞［9］。本研究结果显示，栀子苷抑制了高脂血症ApoE-/-小鼠脾脏中PI3K/AKT/mTOR信号的激活，mTOR信号的激活增加了Th17细胞百分比，降低了Treg细胞百分比；同时mTOR的激活减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。因此，栀子苷可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路调节CD4＋T细胞分化。

综上所述，栀子苷改善了AS的发展，有助于降低促炎细胞因子，提高抗炎细胞因子水平。栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多、Th17细胞减少有关。本研究对栀子苷抗AS发展提供了新方向。

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（收稿日期：2022-06-29）

（本文編辑薛妮）