重构枯草芽孢杆菌的木糖代谢通路生产乙醇酸

摘 要：本研究旨在获得一株可利用麸皮生产乙醇酸的食品安全菌。通过同时过表达xdh和yjhG，构建了基因工程菌XDH-YjhG，该菌株能够利用麸皮生产乙醇酸，产量为3.15 g·L-1。本研究首次证明了可利用麸皮作为碳源生产乙醇酸，为乙醇酸的工业化生产奠定了基础。

关键词：枯草芽孢杆菌；麸皮；乙醇酸

Reconstructing the Xylose Metabolic Pathway of Bacillus subtilis to Produce Glycolic Acid

JI Minghua

（Kinry Food Ingredients Co.， Ltd.， Shanghai 200000， China）

Abstract： This study aims to obtain a food-safe bacterium capable of utilizing wheat bran to produce acetic acid. By co-overexpressing xdh and yjhG， a genetically engineered strain XDH-YjhG was constructed， which could use wheat bran to produce acetic acid with a yield of 3.15 g·L-1. This study is the first to demonstrate the use of wheat bran as a carbon source for the production of acetic acid， laying the foundation for the cost-effective industrial production of acetic acid.

Keywords： Bacillus subtilis; wheat bran; acetic acid

乙醇酸（HOCH2COOH）是最简单的α-羟基酸，别名羟基乙酸或甘醇酸，可广泛用于食品、医药和化妆品等领域。近年来，全生物法合成乙醇酸因其安全无毒、条件温和等特点而广受关注，具有较好的前景。利用代谢工程手段，改造菌株的D-木酮糖-1-磷酸途径、Dahms途径或乙醛酸旁路途径等，可以实现乙醇酸的全生物合成[1]。

枯草芽孢杆菌已获得“GRAS”和“QPS”双料认证，菌株安全。本研究以枯草芽孢杆菌为出发菌，通过木糖脱氢酶编码基因xdh和木糖酸脱水酶编码基因yjhG的异源表达，构建了一株食品安全菌。实验证明该菌株可利用麸皮生产乙醇酸，该研究对于以廉价生物质生产乙醇酸具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株质粒

实验所用菌株164T7P为实验室保存，T7P-YjhG、XDH、XDH-YjhG为本文构建；质粒pMK4-PxylA-yjhG、pMK4-T7、pUC57-xdh和pMD19T-aea为实验室保存，pMK4-T7-yjhG为本文构建。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备

细胞培养使用LB培养基。添加1%木糖为诱导培养基；添加1%木糖和1%木糖酸为木糖酸发酵培养基；添加2%木聚糖为木聚糖发酵培养基；添加6%麸皮为麸皮发酵培养基。

1.2.2 质粒构建

采用Simple Cloning的方式在枯草芽孢杆菌中进行质粒pMK4-T7-yjhG的构建[2]，使用引物见表1。在添加氯霉素的LB抗性固体板上筛选出阳性转化子，提取质粒测序验证。

1.2.3 基因表达盒的构建

用于敲入xdh基因的基因表达盒xdh cassette通过融合PCR方法构建得到，PCR扩增过程参考文献[3]。所用的引物序列（5’→3’）见表2。

1.2.4 枯草芽孢杆菌转化及菌种构建

菌株构建方法参考文献[3]。质粒pMK4-T7-yjhG转化枯草芽孢杆菌164T7P，涂布于氯霉素抗性平板筛选，得到的阳性转化子命名为T7P-YjhG；基因表达盒xdh cassette转化枯草芽孢杆菌164T7P，涂布于红霉素抗性平板筛选，得到的阳性转化子命名为XDH；进一步地，质粒pMK4-T7-yjhG转化枯草芽孢杆菌XDH，涂布于氯霉素抗性平板筛选，所得到的阳性转化子命名为XDH-YjhG。

1.2.5 发酵实验

研究采用摇瓶发酵实验。在LB中接种，37 ℃、200 r·min-1隔夜培养；然后将过夜培养物转接至摇

瓶，培养基分别为木糖酸发酵培养基、木糖发酵培养基、木聚糖发酵培养基或麸皮发酵培养基，于摇床中37 ℃、200 r·min-1进行培养。

1.2.6 发酵产物的检测与分析

发酵液样品处理：取1 mL发酵液于12 000 r·min-1离心5 min，取上清液进行检测。液相条件：色谱柱型号为Aminex HPX-87H column，使用硫酸溶液（0.005 mmol·L-1）作为流动相，设置流速为0.6 mL·min-1，柱温为65 ℃。

2 结果与分析

2.1 在枯草芽孢杆菌中过表达yjhG

枯草芽孢杆菌中缺乏乙醇酸生产的关键酶，不能经由木糖酸生成乙醇酸。本实验室前期研究证明，只需过表达yjhG，后续借助枯草芽孢杆菌内源性酶，即可使枯草芽孢杆菌将木糖酸最终转化为乙醇酸[4]。为了进一步优化乙醇酸转化率，本研究从实验室构建的164T7P出发，采用更高效的T7启动子作为表达元件，过表达yjhG基因，构建了菌株T7P-YjhG[图1（a）]。图1（b）的曲线为发酵72 h上清液液相结果，深色为164T7P发酵液上清样品，浅色为T7P-YjhG发酵液上清样品，表明乙醇酸合成通路构建成功。发酵生产乙醇酸的检测结果如图1（c）所示，T7P-Yjh共积累乙醇酸0.93 g·L-1，消耗木糖酸3.85 g·L-1，摩尔转化率为52.74%。前期实验结果显示，在使用PxylA为启动子时，消耗木糖酸生产乙醇酸的摩尔转化率为42.54%，这表明采用T7作为表达元件，针对木糖酸的转化率更为高效。

2.2 利用麸皮生产乙醇酸

枯草芽孢杆菌仅能将木糖磷酸化，使其流向磷酸戊糖途径，但不能将其转化为木糖酸。为使木糖代谢流向乙醇酸，而不是进入磷酸途径，本研究首先敲除了xylA-xylB片段[5]，同时将木糖脱氢酶编码基因xdh通过同源重组的方式，整合到菌株基因组DNA，构建了枯草芽孢杆菌XDH。在木糖培养基中进行摇瓶发酵评价，研究Xdh蛋白的表达效果。发现菌株XDH能够将木糖转化为木糖酸，120 h木糖完全消耗，积累木糖酸17.51 g·L-1，摩尔转化率为79.12%（数据未展示）。

将质粒pMK4-T7-yjhG转化到枯草芽孢杆菌XDH，构建了XDH-YjhG，评价其对木糖、木聚糖和麸皮的转化能力，见图2。

在含20 g·L-1木糖的LB培养基中进行摇瓶发酵评价，研究菌株是否能够生产乙醇酸，发酵结果见图2（a）。由结果可知，XDH-YjhG可以生成乙醇酸，最终积累产量为0.99 g·L-1。为探究所构建的XDH-YjhG能够利用木聚糖生产乙醇酸，本研究在含

20 g·L-1的木聚糖培养基中开展了发酵研究。由结果可知，XDH-YjhG可以利用木聚糖生成乙醇酸，最终积累产量为1.20 g·L-1，与木糖相比，其产量增加了21.21%。本研究进一步在麸皮发酵培养基中开展研究，由图2（a）可以看到乙醇酸产量最终最高达到3.15 g·L-1。推测枯草芽孢杆菌可通过内源性木聚糖酶，水解出麸皮中的木糖单体，而木糖进一步在Xdh的催化下生成木糖酸，然后经由Dahms途径生成乙醇酸，见图2（b）。

3 结论

本研究证明，在枯草芽孢杆菌中仅需表达yjhG基因就可实现木糖酸到乙醇酸的转化；共表达xdh和yjhG，并敲除xylA-xylB片段，可重构枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，使其可利用麸皮产乙醇酸。综合上述研究结果，本研究首次证明了使用麸皮发酵生产乙醇酸的可行性，为食品级生物基的乙醇酸的廉价生产奠定了基础。

参考文献

[1]SALUSJÄRVI L，HAVUKAINEN S，KOIVISTOINEN O，et al.Biotechnological production of glycolic acid and ethylene glycol： current state and perspectives[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2019，103：2525-2535.

[2]YOU C，ZHANG X Z，ZHANG Y H P.Simple cloning via direct transformation of PCR product （DNA Multimer） to Escherichia coli and Bacillus subtilis[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78（5）：1593-1595.

[3]JI M H，LI S J，CHEN A，et al.A wheat bran inducible expression system for the efficient production of α-L-arabinofuranosidase in Bacillus subtilis[J].Enzyme and Microbial Technology，2021，144：109726.

[4]凌翓，纪明华，段海燕，等.木糖酸氧化途径在枯草芽孢杆菌的构建及转化乙醇酸的研究[J].生物技术通报，2019，35（6）：76-82.

[5]CHEN J Q， ZHU Y M， FU G，et al.High-level intra-and extra-cellular production of D-psicose 3-epimerase via a modified xylose-inducible expression system in Bacillus subtilis[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2016，43（11）：1577-1591.

作者简介：纪明华（1989—），男，河北临西人，博士，工程师。研究方向：生物化工、食品微生物。