我国农药分析部分检测技术标准现状及比较分析郑琼英

晋文慧　周莉英　邓虹霄　刘伟　向平　陈航　沈保华

关键词：农药检测，标准，综述

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.01.038

0 引言

农药是指农业上用于防治病虫害及调节植物生长的化学药剂[1]，当前我国农药产品登记信息逾4万条[2]，与农药相关的涉毒案事件时有发生[3-4]。

常见高、剧毒农药有八甲磷、乙硫磷、苯硫磷、三硫磷、甲基内吸磷、毒鼠磷、敌敌畏、华法林、杀鼠醚、溴敌隆、大隆、氟鼠灵、敌鼠、氯敌鼠、杀鼠酮、异杀鼠酮、三氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯和阿维菌素等[5]，因其具有较高的急性毒性，是法医毒物学研究始终关注的目标化合物群体。禁限用农药除危害性外，还拥有不得（限制）使用的法律属性，在公共法律服务当中，受社会关注度更高。

农药的检测方法随科技的进步呈多样化的发展趋势。但是在社会检测服务中，经过标准化整理，相对更为单一的检测技术运用则更有利于结果的普适化和统一化，是社会裁判与公信力统一的基础之一。《国家标准化发展纲要》（国市监标技发〔2022〕64号）提出，需完善现代服务业标准支撑、完善行政管理和社会治理标准体系、实施基本公共服务标准体系建设工程。《司法鉴定程序通则》（司法部令 第132号）也明确规定：司法鉴定服务的展开，必须依序遵守和采用该专业领域的国家标准、行业标准和技术规范或该专业领域多数专家认可的技术方法执行。因此，相关领域的标准化工作越来越受到重视。

基于上述背景，本文整理现行有关于禁限用农药和部分高、剧毒农药的110项检测类国家标准（GB）、公安安全行业标准（GA）、司法行政行业标准（SF）、农业行业标准（NY）和地方标准（DB），分别就样品处理方法、仪器分析方法及标准规定的结果评价方式进行整理归纳，展示现行标准中分析技术的应用情况，以期为社会检测服务实践提供基础性信息，并尝试为法医毒物学及相关领域标准化研究提供参考。

1 样品处理技术选取

本文综述的110篇技术标准，涉及的样品处理技术有固相萃取法（S P E）、分散固相萃取法（DSPE）、液-液萃取法（LLE）、凝胶渗透色谱法（GPC）。其中，SPE应用率约35%，DSPE约8%，LLE应用率约58%，GPC应用率约11%。各样品处理技术的应用率总和超过100%，是因为一些标准中使用了多种样品处理技术。并非所有样品技术标准都被使用，NY中SPE的应用率较其他几类标准高，而SF中LLE的应用率较其他几类标准高，GB、GA和DB中SPE和LLE的应用率几乎相同。

1.1 SPE

SPE是由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来的，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化[7]。在综述标准中，常使用含氨基官能团聚合物的固相萃取填料，其他的固相萃取填料还包括弗罗里硅土、水油平衡（HLB）、C18、氧化铝等。乙腈和甲苯的混合溶剂是最为常用的洗脱溶剂，其他使用的洗脱溶剂还包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯代烷烃、氯代烷烃和甲醇的混合溶剂、乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂等。

1.2 DSPE

与传统SPE相比，DSPE省时、简单、不需要对操作者进行特别的培训。DSPE通过吸附剂填料吸附待测溶液中的杂质从而达到除杂净化的目的。提取剂一般选用丙酮、乙酸乙酯、乙腈等，吸附剂包括PSA（乙二胺基-N-丙基）、硅胶、弗罗里硅土、C18等。

1.3 LLE

L L E是农药分析的传统处理方法。由于超声振荡器和高速离心机的使用，提高了LLE的提取效率。在综述标准中，常用的提取溶剂有丙酮、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮和石油醚等单一溶剂或环己烷-乙酸乙酯、甲醇-氯代烷烃、乙腈-氯代烷烃和乙酸乙酯-氯代烷烃等混合溶剂，且均留取有机相。GA中LLE用乙酸乙酯处理生物检材居多，而SF中LLE用乙醚处理样品居多。

对于非生物样本（农药原药），直接溶解和稀释可视为是LLE的一种变体。标准中对农药原药的分析方法常使用溶剂直接溶解或稀释的方式，如标准中用甲醇来溶解水胺硫磷原药；用三氯甲烷来溶解特丁硫磷原药；用丙酮来溶解六六六；用蒸馏水来溶解百草枯原药；用二硫化碳来溶解林丹原药等。

1.4 GPC

GPC基本原理是按照不同相对分子质量进行分离。其优点是省时、方便、环境污染少、敏感度较高、可有效去除色素和脂肪；其缺点是分离不完全、残留农药与样品的基底产生重叠等。GPC还必须依靠另外的方式来配合进行，一般有液-液萃取或固-液萃取法[8]。例如GB/T 20770-2008中对试样的处理就是使用了GPC。

1.5 其他

1.5.1 蛋白沉淀及衍生化方法

沉淀蛋白技术是为了解决生物检材中的蛋白干扰问题；衍生化技术是为了解决有些农药残留物对检测仪器没有响应或响应较弱，不能直接检测的问题，可以增加农药残留检测的种类、降低检测成本等[9]。蛋白沉淀及衍生化技术常用于生物检材中对农药的检测，如GA/T 1623-2019对血液等检材样品的处理。

1.5.2 方法联合使用

有时单纯的使用一种处理方法无法直接进仪器检测，所以会使用方法联用。GB/T 2795-2008中试样用环己烷和乙酸乙酯混合溶剂均质提取，提取液浓缩后经GPC和SPE净化，浓缩，待仪器检测。

2 分析方法技术选取

本综述的技术标准中，分析方法有生物化学法（酶联免疫吸附法，约占1%），红外光谱法（IR，约占8%）、色谱法（约占64%，气相色谱法占42%，液相色谱法约占22%）和色谱-质谱联用法（约占60%，单级质谱法约占23%，多级质谱法约占34%，高分辨质谱法约占3%）。

2.1 生物化学检测法

生物化学检测法主要有酶联免疫法和酶抑制法。酶联免疫法是通过抗原和抗体之间的酶联免疫反应。酶抑制法中胆碱酯酶抑制法是最常用的方法，用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测，将该酶与样品提取液反应，如果存在有机磷和氨基甲酸酯类农药，酶活性会受到抑制[10]。因交叉免疫导致的低特异性，使得相关方法一般仅用于预试筛查，不能用作确证方法。所以生物化学检测法相关的技术标准在法医毒物学研究，尤其是司法鉴定实践中，实际使用的价值有限，应谨慎选择相关方法进行鉴定活动。

2.2 光谱法

GB 20678-2006中使用此法定性分析。几乎所有的有机化合物在红外光区均有吸收，分子中不同官能团在发生振动和转动能级跃迁所需能量各不相同，产生的光谱含有分子中官能团特征的精细结构信息，是物质结构鉴定的有效手段。标准中使用IR对农药纯品进行定性，并不用该法进行确证，在司法鉴定实践中该法无法满足定量的要求，实际使用的价值有限。

2.3 色谱法

2.3.1 气相色谱法（GC）

GC是一种以气体为流动相，采取冲洗法的柱色谱分离技术。利用各组成成分在色谱柱中固相和气相分配系数的不同来达到样品的分离，反应灵敏度高，性能比较稳定，对大多数物质都有检测反应[11]。气相色谱仪后可带的检测器有电子捕获检测器（ECD，约占比26%）、氢火焰离子检测器（FID，约占比26%）、火焰光度检测器（FPD，约占比20%）、氮磷检测器（NPD，约占比24%）等，上述检测器在110篇标准中使用占比相当。

2.3.2 液相色谱法（LC）

高效液相色谱（HPLC）是以液相色谱柱层析为基础，可以对GC不能分析的高沸点和热不稳定的农药进行有效分离测定。该方法的优点是高速、高效、稳定。本文综述的标准中液相色谱接可变波长紫外检测器是最常见的。

GC中最常用的柱子DB-5柱，其他使用的柱子有OV-101柱和DB-1701；LC中最常用的柱子是C18柱，其他使用的柱子有C8柱和五氟苯基柱等，柱子的极性不同可以分离不同极性的物质；最常用的流动相是乙腈和甲酸水溶液，其他使用的流动相包括甲醇和乙酸水溶液、乙腈和水、甲醇和水等。

2.4 色谱-质谱联用法

2.4.1 单级质谱

色谱的分离能力结合MS独特的选择性，能对样品进行准确的定性和确认。GC-MS 适用于小分子、热稳定性强、易挥发、气化性好的化合物。LC-MS适用于极性、挥发性较弱的化合物以及热不稳定性的和分子量大的化合物[12]。实际应用如GA/T 187-2021。

2.4.2 多级质谱法

色谱-串联质谱法是通过多级质谱筛选，可降低背景干扰，进一步提高检测灵敏度。G B / T23208-2008和GB/T 23214-2008标准中都使用的液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）；都使用BOX SB-C18 柱；使用的流动相也相同，检测农药的种类多，能满足多种农药一起检测的需求。

2.4.3 高分辨质谱

HRMS有更高的灵敏度和分辨率，可以快速准确获得化合物的精确质量，现主要用于农药及其转化产物的靶向以及非靶向分析和筛查[13]。常与色谱联用，如GA/T 1905-2021中使用LC-HRMS来检测抗凝血鼠药。

3 结果判断及结果评价一致性分析

结果判断与结果评价是法医毒物分析工作的重要组成部分。结果判断的完善性决定了分析结论的证据价值；结果判断的准确性决定了分析结论的正确性；结果评价反映了分析结论的完善性和准确性。本文分别从定性、定量两个维度对现行有关于禁限用农药和部分高、剧毒农药的110项标准进行整理归纳。

3.1 定性判断依据

在本文综述的技术标准中，定性判断依据主要指标包括：（1）光谱方面。光谱图与标准品的光谱图进行比对。（2）色谱方面。保留时间（RetentionTime，RT）。（3）质谱方面。特征离子（m/z）、特征离子的相对丰度、母离子-子离子对和离子对丰度比。（4）生物化学检测方面。物质吸光度值、酶抑制率。不同的技术标准，其设立的定性判断依据不一定都相同。本部分主要讨论标准中色谱与质谱方面的定性判断依据的差异。

3.1.1 RT

RT是色谱法定性判断的重要依据，不同的技术标准，对农药检测给出的定性判断依据有很大的差异。有些标准要求是RT定性，如DB37/T 642-2006；有些标准要求是RT一致（±0.05 min），如DB22/T2084-2014；有些标准要求是RT相对误差，如GA/T1901-2021等；有些标准要求是试样溶液某色谱峰的RT与标样溶液的RT的相对差值应在1.5%之内，如GB 29384-2012；有些标准要求是以样品RT定性，RT允许偏差为±3%之内，如DB37/T 4157-2020。

标准中同样是使用RT相对误差定性，但对相对误差的容忍度是不同的。例如上述RT相对误差例子，举例的标准中对RT相对相差的容忍度分别是±1%、±2%、±2. 5%。

3.1.2 质谱特征

技术标准不同，在质谱方面的定性判断依据也各有不同。质谱一般与色谱联用，对定性判断依据包括色谱和质谱两方面。色谱方面一般是以RT作为定性判断的依据，色谱方面的定性判断依据如本文3.1.1所述，本小节不再赘述。

本文所述的技术标准中，最常用的与液相色谱联用的质谱离子源是电喷雾离子源，检测方式最常使用多反应监测（MRM），选择正离子或负离子扫描；最常用的与气相色谱联用的质谱离子源是电子轰击源（EI），常选择离子检测（SIM）。

技术标准中关于液相色谱联用质谱方面的定性判断依据有的要求选择1个母离子和2个子离子，扣除背景后的样品质谱图中，所选的离子对均出现且与标准溶液一致，而且所选择的相对离子对丰度与质量浓度相当的标准工作溶液（为了减少基质的干扰，一般会选择基质标准溶液）相比，其允许偏差不超过表2规定的范围；有的要求每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，可判定样品中存在对应的待测物；有的要求选择1个母离子和2个子离子，待测样品与外标标准品相比，样品中待测组分两个定性子离子的相对丰度比不大于10%。

标准中关于气相色谱联用的单级质谱方面的定性判断依据有的要求选择1～3个定性离子，有的要求选择2～3个定性离子。当扣除背景后的样品质谱图中，所选的定性离子均出现且与标准溶液一致，其离子丰度比与浓度相当的标准工作溶液相比，相对偏差不超过表1规定的范围。对于气相色谱联用的多级质谱方面的对特征离子丰度比的最大允许相对偏差不超过表2规定的范围。

标准中的高分辨质谱的定性判断如DB3 4 / T2820-2017中是以各化合物标准溶液进行质谱扫描获得330种目标化合物的特征碎片离子和、RT等信息，计算各化合物的精确质量数，建立基于精确质量数、RT和质谱图信息的筛查列表，同时设置判定标准，建立330种农药精确质量数据库。通过分子离子的精确质量偏差、同位素分布、同位素比例和RT对农药残留进行定性测定。

3.1.3 检出限

农药化合物在不同标准中的检出限不同是当前标准中常出现的矛盾性问题。例如艾氏剂在标准GB/T 2795-2008、DB37/T 644-2006、GB/T 19650-2006中的检出限分别是0.05、0.001、0.025 mg/kg。

检出限的差异从技术上是可以理解的，因为不同的样品处理方法、差异化的仪器分析技术，最终会导致检测能力的差异。但从标准化工作角度，同一目标化合物的检出限差异会增加在实践中引发矛盾的可能性。当同一份样本，在不同的机构，按照不同的标准开展分析后，差异化的检出限甚至有可能导致结果阴性与阳性的差别。若结果的使用方法无法很好理解技术标准差异是导致这一问题的根源，则可能成为矛盾的爆发点。

本文综述的110项技术标准中，并非所有有关于我国禁、限用和高、剧毒农药化合物都有检测标准，如毒鼠硅、福美胂、福美甲胂、铅类等在本文综述的标准中没有涉及。

3.2 定量方法差异

本文综述的标准中常用来定量的方法有四种，分别是内标-单点定量法、内标-标准曲线定量法、外标-单点定量法、外标-标准曲线定量法。有些会同时给出这四种方法来定量，SF/Z JD0107018-2018同时平行测定两份待测样品，计算双样相对相差，并且会用空白基质进行空白试验，定量结果按两份样品浓度的平均值计算。有些选择其中的一种或两种来定量，GB/T 21320-2007中使用外标-单点定量法，要求样品溶液和相应浓度的基质添加标准溶液作单点校准，以色谱峰面积积分值定量。

有些对平行测定的结果有要求，GB 2 4753-2009中要求两次平行测定结果之差应不大于1.2%，取其算术平均值作为测定结果；GB/T 20619-2006要求两次平行测定结果之差，应不大于0.5%，取其算术平均值作为测定结果。

本文综述的关于禁限用农药和部分剧、高毒农药的现行GA、SF中一般都会给出分析结果的评价，如SF/Z JD0107005-2016对定量结果评价是平行试验中两份样品的双样相对相差不超过20%（腐败样品不超过30%），结果按两份样品浓度的平均值计算，否则需要重新测定。

而现行有关于禁限用农药和部分高、剧毒农药GB、NY和DB大部分都只给出了分析结果，并没有对分析结果进行评价，但是有些给出了方法验证参数，如DB15/T 1476-2018中给出了精密度，要求在实验室内重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值10%，在实验室间再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的30%。DB22/T 2084-2014中给出了精密度，获得重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。

4 结语

就上述对标准中农药的样品处理、仪器方法和结果评价的整理归纳可以看出，农药的样品处理方法有多种可供选择，仪器方法也有多种可供选择，农药检测可结合农药特性和承载农药的样本基质特性等方面，合理地选择方法，以确保实验结果的准确。

一方面，标准对结果评价的严格不一，对定性和定量的判断依据并不完全相同，存在同一目标农药在不同标准中检出限不同的情况，即标准之间的统一性并不好。另一方面，对于某些农药来说，并无适用标准可以直接使用；个别标准标龄超过10年，技术平台陈旧，与现行技术水平不相适应。本文通过对110项农药检测技术类标准综述展示出了上述两个问题，表明需开展更多系统的、严格的实验和科学研究验证，从标准化体系建设与标准验证双角度开展进一步工作。相信不久的将来，各技术标准的统一性会越来越好。

作者简介

郑琼英，硕士，主要从事法医毒物分析研究工作。

陈航，通信作者，副主任法医师，主要从事法医毒物分析及标准化研究工作。

沈保华，主任法医师，主要从事法医毒物分析研究工作。

（责任编辑：张瑞洋）