醒脑静注射液“异病同治”急性脑梗死与急性脑出血作用机制的网络药理学研究

彭景 陈星 吕秋艺 宋蕾 邹忆怀

摘要  目的：采用网络药理学探讨醒脑静注射液“异病同治”急性脑梗死（ACI）与急性脑出血（ACH）的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）与中医药综合数据库（TCMID）获得醒脑静注射液的有效成分及其作用靶点，同时利用人类基因数据库（GeneCards）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、遗传药理学和药物基因组学数据库（PharmGkb）、治疗目标数据库（TTD）和药物靶标数据库（DrugBank）等数据库获取ACI和ACH潜在的基因靶点，在DIAGRAMS平台内绘制共同靶点韦恩图。采用Cytoscape 3.9软件构建醒脑静注射液“药物-活性成分-潜在靶点”相互作用网络图。利用STRING构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络并进行拓扑分析。通过R/BioConductor对共同靶点进行基因本体（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：筛选共得到醒脑静注射液药物活性成分68种，对应靶点基因583个，ACI潜在靶点3 597个，ACH潜在靶点3 959个，三者共同靶点299个；PPI网络核心蛋白包括血管内皮生成因子A（VEGFA）、JUN转录因子（JUN）、信号转导与转录激活因子3（STAT3）、白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）、清蛋白（ALB）、胱天蛋白酶 3（CASP3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、表皮生长因子受体（EGFR）、表皮生长因子（EGF）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、IL-1β、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等；其主要生物学通路涉及脂质与动脉粥样硬化、MAPK信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、凋亡、IL-17信号通路等。结论：醒脑静注射液通过抗氧化应激、抗炎症反应、抗细胞凋亡和促血管生成等作用机制达到“异病同治”ACI和ACH的疗效。

关键词  急性脑梗死；急性脑出血；醒脑静注射液；网络药理学；异病同治

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.005

Mechanism of "Different Diseases with Same Treatment" with Xingnaojing Injection for the Treatment of Acute Cerebral Infarction and Acute Cerebral Hemorrhage Based on Network Pharmacology

PENG Jing， CHEN Xing， LYU Qiuyi， SONG Lei， ZOU Yihuai

Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China; Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Corresponding Author  ZOU Yihuai， E-mail： zouyihuai2004@163.com

Abstract  Objective：To explore the mechanism of "different diseases with same treatment" of Xingnaojing injection for  treating acute cerebral infarction（ACI） and acute cerebral hemorrhage（ACH） by network pharmacology.Methods：The effective components and the targets of Xingnaojing injection were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and Traditional Chinese Medicine Integrated Database（TCMID）.The potential gene targets of ACI and ACH were obtained by GeneCards，OMIM，PharmGkb，TTD，and DrugBank.The common target Venn diagram was drawn by DIAGRAMS.The interaction network of "drugs-active ingredients-potential targets" was constructed by Cytoscape 3.9 software.Finally，the protein-protein interaction（PPI） network was constructed by STRING and topology analysis was carried out.Gene ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment of common targets were analyzed by R/BioConductor.Results：There were 68 active components of Xingnaojing injection，583 corresponding target genes，of which 3 597 potential targets were related to ACI，3 959 potential targets were related to ACH，and there were 299 common targets.PPI network core proteins included vascular endothelial growth factor A（VEGFA），JUN，signal transducers and activators of transcription 3（STAT3），interleukin（IL）-6，tumor necrosis factors（TNF），serum albumin（ALB），caspase-3（CASP3），protein kinase（AKT）1，mitogen activated protein kinase（MAPK）3，hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α），epidermal growth factor receptor（EGFR），epidermal growth factor（EGF），recombinant prostaglandin endoperoxide synthase 2（PTGS2），IL-1β，matrix metalloproteinase 9（MMP-9）;mainly pathway involved in lipid and arteriosclerosis，MAPK signal pathway，fluid shear stress and arteriosclerosis，TNF signal pathway， apoptosis，IL-17 signal pathway and so on.Conclusion：Xingnaojing injection achieves the therapeutic effect on ACI and ACH by anti-oxidative stress，anti-inflammatory reaction，anti-apoptosis，and promoting angiogenesis.

Keywords    acute cerebral infarction; acute cerebral hemorrhage; Xingnaojing injection; network pharmacology; different diseases with same treatment

基金项目  国家自然科学基金项目（No.81904285）；北京市自然科学基金项目（No.7182104）

作者单位  1.北京中医药大学东直门医院（北京 100700）；2.北京中医药大学（北京 100029）

通讯作者  邹忆怀，E-mail：zouyihuai2004@163.com

引用信息  彭景，陈星，吕秋艺，等.醒脑静注射液“异病同治”急性脑梗死与急性脑出血作用机制的网络药理学研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（2）：231-238.

急性脑梗死（acute cerebralinfarction，ACI）与急性脑出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）为常见的两种脑血管急症，合称为脑卒中，是由于脑部血管突发阻塞或破裂，血液不能流入大脑而导致脑组织缺血、缺氧性损伤［1］，具有起病急、病情进展迅速的特点，以其高发病率、高致残率、高死亡率严重危害人类的健康［2］。因此，ACI和ACH的诊疗策略以及药物脑保护机制一直是脑损伤防治领域的研究重点，现研究发现治疗中联合醒脑静注射液可有效提高脑卒中病人的临床疗效，在改善ACI和ACH神经功能缺损方面有效且安全［3-6］。

醒脑静注射液方药源自临床使用200余年的经典急救名方“安宫牛黄丸”，由麝香、冰片、栀子和郁金4味中药经科学提取精制而成，是国内唯一获批用于脑缺血和出血性脑卒中急救的中药注射液［7］。方中麝香、冰片气味芳香走窜，能通诸窍不利，为通窍醒脑之要药，又擅泻火毒、化瘀血、散热结；栀子、郁金性味苦寒、清热泻火、凉血解毒、化痰开郁，清利三焦痰瘀热邪，并助开窍通络。诸药合用，共奏开窍醒脑、安神定志、清热解毒、镇惊止痛、凉血行气之功，有“异病同治”之效。但其处方组成的合理性及作用机制的科学内涵尚未阐明，遂本研究利用网络药理学技术对醒脑静注射液“异病同治”ACI和ACH的有效成分及作用靶点进行预测分析，以期进一步揭示其药理作用，为醒脑静注射液临床应用推广和作用机制研究提供理论基础和科学依据。

1  资料与方法

1.1  醒脑静注射液活性成分与靶点筛选

运用中药系统药理学数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）与中医药综合数据库（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID），分别以“麝香”“冰片”“郁金”“栀子”为关键词检索其活性成分，通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）分别查找各活性成分的化学结构式，导入Swiss ADME平台（http：//www.swissadme.ch/）筛选，符合“胃肠吸收度”为“high”，以及“类药性”的5个过滤器属性值中有2项或以上为“yes”的通过筛选，获取有效成分。运用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测各有效成分的靶点，设置“probability＞0”的靶点为有效靶点，运用UniProt蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org/）统一将蛋白质靶点信息标准化为相应的UniProt ID。收录符合条件的活性成分及对应靶点。

1.2  ACI和ACH潜在疾病靶点筛选

分别以“acute cerebral infarction”和“acute cerebral hemorrhage”为检索词，从人类基因数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.org/）、遗传药理学和药物基因组学数据库（PharmGkb，https：//www.pharmgkb.org/）、治疗目标数据库（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）和药物靶标数据库（DrugBank，https：//www.drugbank.com/）中检索，合并5个数据库信息，去重后得到ACI和ACH潜在靶点。

1.3  共同靶点获取

利用DIAGRAMS（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）在线工具平台，将醒脑静注射液各活性成分靶点与ACI、ACH疾病潜在靶点分别导入，取交集并绘制韦恩图。

1.4  “药物-活性成分-潜在靶点”调控网络构建

利用Cytoscape 3.9软件导入所获得的药物活性成分、潜在靶点等信息及相互作用关系，构建醒脑静注射液治疗ACI、ACH的“药物-活性成分-潜在靶点”可视化调控网络。

1.5  蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建与拓扑分析

将共同靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，同时去掉游离的靶点，构建PPI网络。将PPI网络数据导入Cytoscape 3.9软件并利用CytoNCA APP进行网络拓扑分析，先以Betweenness值＞61为标准筛选，再提取Degree值排前15位的靶点作为核心蛋白靶点网络。

1.6  基因本体（gene ontology，GO）及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

在BioConductor检索“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”“pathview”安装语言，并在R中安装，同时安装“colorspace”“stringi”“ggplot2”。对筛选的共同靶点进行靶点GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，筛选出具有统计学意义的生物学过程和信号通路，均以P＜0.05为标准。并将KEGG富集分析结果导入Cytoscape 3.9软件进行拓扑分析，构建KEGG关系网络。

2  结  果

2.1  醒脑静注射液药物活性成分与靶点预测

依照上述检索与筛选标准，收集醒脑静注射液药物有效成分信息见表1，去重后获得活性成分68个及相应靶点基因583个。

2.2  醒脑静注射液“异病同治”ACI和ACH潜在靶点筛选

通过GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank等数据库收集并去重后获得ACI潜在靶点3 597个及ACH潜在靶点3 959个，与药效靶点取交集后得到299个共同靶点，视为醒脑静注射液治疗ACI和ACH“异病同治”效应潜在的作用靶点。详见图1。

图1  醒脑静注射液治疗ACI和ACH靶点韦恩图

2.3  “药物-活性成分-潜在靶点”调控网络构建

将醒脑静注射液药物活性成分与ACI、ACH药效作用靶点导入Cytoscape 3.9软件，构建“药物-活性成分-潜在靶点”调控网络图（见图2），共有367个节点（包括68个活性成分及299个潜在靶点基因）和1 244条边，许多靶点可以通过多种活性成分进行调控，并存在单个活性成分与多个靶点的相互作用。运用网络拓扑分析得到各节点度值，Degree值排名前10位的核心活性成分及其详细信息见表2，Degree值排名前10位的潜在靶点为前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、细胞色素P450 19A1酶（CYP19A1）、羟基类固醇脱氢酶11β1（HSD11B1）、花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）、性激素结合球蛋白（SHBG）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、雌激素受体1（ESR1）、细胞色素P450 17A1酶（CYP17A1）、雌激素受体2（ESR2）、组织蛋白酶K（CTSK）等。

2.4  PPI网络的构建及拓扑分析

通过STRING数据库和Cytoscape 3.9软件对上述299个醒脑静注射液作用靶点进行蛋白质相互作用信息分析并构建PPI网络，运用CytoNCA APP进行网络拓扑分析，根据Betweenness值和Degree值筛选出核心蛋白网络，包括血管内皮生成因子A（VEGFA）、JUN转录因子（JUN）、信号转导与转录激活因子3（STAT3）、白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）、清蛋白（ALB）、胱天蛋白酶（CASP）3、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、表皮生长因子受体（EGFR）、表皮生长因子（EGF）、PTGS2、IL-1β、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等。详见图3。

2.5  GO富集分析结果

将醒脑静注射液治疗ACI和ACH的299个作用靶点基因导入R软件进行富集分析，GO分析排前10位的结果见图4，其中，生物过程（biological process，BP）主要涉及对外源性刺激的反应、氧化应激反应、伤口愈合、脂多糖反应等；细胞组分（cellular component，CC）包括膜微结构域、膜筏、细胞-基底连接、黏着斑、神经元细胞体等；分子功能（molecular function，MF）主要富集在蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、内肽酶活性、血红素结合、跨膜受体蛋白激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等。

2.6  KEGG富集分析及关系网络构建

KEGG富集分析结果显示P＜0.05的醒脑静注射液治疗ACI和ACH的信号通路共176条，主要相关通路为脂质与动脉粥样硬化、MAPK信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、凋亡、IL-17信号通路等。详见图5。将KEGG富集分析结果与相关基因靶点导入Cytoscape 3.9软件进行拓扑分析，构建KEGG关系网络，图形大小代表连接节点的数量，可见MAPK3、MAPK1、AKT1、RELA癌基因（RELA）、螺旋环螺旋结构域扩散激酶（CHUK）、核因子κB（NF-κB）激酶亚基β抑制因子（IKBKB）、STAT3、MAPK10、MAPK8、MAPK9、丝裂原激活蛋白激酶激酶1（MAP2K1）、CASP、MAPK14、JUN、NF-κB抑制因子α（NFKBIα）等可能是醒脑静注射液治疗ACI和ACH的核心靶点。详见图6。绘制与ACI、ACH关系密切的2条信号通路机制图。详见图7。

3  讨  论

ACI和ACH为临床难治性疾病，其病理机制分别为脑组织缺血性和出血性损伤，学术界普遍认同二者病理生理过程中引发的氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、兴奋性毒性等复杂的生化和分子机制相互关联，参与脑缺血、脑水肿、血脑屏障通透性改变和神经元凋亡等一系列神经系统损害［8］。且临床研究证实醒脑静注射液通过减轻免疫炎性反应、抗氧化应激损伤、参与新生血管形成等机制保护受损脑组织，促进神经功能恢复，应用于脑血管疾病疗效肯定［9］。而从中医学角度来看，ACI和ACH统称“中风病”，其中ACI源于风火痰瘀、痹阻脑络，而ACH源于风火灼伤脑络、络破血溢，均致气血逆乱、上扰脑窍、神明失用，为中风病之核心病机［10］，表现为突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、言语謇涩或不语、偏身麻木等典型症状［11］。中风病急性期标实症状突出，本着“急则治其标”的原则，早期围绕核心病机予醒脑开窍、醒神回厥治法，对证首选醒脑静注射液凉血解毒、开窍醒脑、行气活血，进行共性治疗。可见，ACI和ACH的中医核心病机与西医病理机制共同为醒脑静注射液“异病同治”的基础。

本研究通过数据库筛选与网络构建发现，醒脑静注射液“异病同治”ACI和ACH的关键活性成分有槲皮素、栀子苷、桑色素、青蒿素和山柰酚等，可调节醒脑静注射液治疗的大多数靶点，且均可透过血脑屏障对ACI和ACH后受损的神经细胞产生良好的保护作用。槲皮素具有抗氧化反应、清除自由基、抗炎、抗血栓、抑制细胞凋亡的独特神经保护作用，在中枢神经系统疾病的病理生理过程中可作为一种神经保护物质［12］。栀子苷营养神经的作用显著，Chiu等［13］在细胞实验中证实其能诱导PC12细胞神经突生长，并伴有神经元分化，可能与作用于MAPK/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路有关，亦有研究认为其抗氧化和解毒功能也是脑保护的机制之一［14］。桑色素可通过下调炎性递质NF-κB、Toll样受体4（TLR4）和多聚ADP核糖聚合酶1（PARP1）等的表达而抑制炎性反应，促进脑缺血受损神经功能的恢复［15］。青蒿素是治疗疟疾最有效的药物之一，此外，研究表明青蒿素及其衍生物可抵抗氧化应激来发挥营养和保护神经的作用［16-17］。山柰酚通过调节NF-κB、p38MAPK和AKT等重要的炎症信号通路，促进抗炎和抗氧化应激作用［18］，从而发挥多种脑神经保护功能。

通过STRING数据库对醒脑静注射液“异病同治”ACI和ACH的共同靶点构建PPI网络显示，核心靶点包括VEGFA、JUN、STAT3、IL-6、TNF、ALB、CASP3、AKT1、MAPK3、HIF-1α、EGFR、EGF、PTGS2、IL-1β、MMP-9等。主要涉及以下机制，1）血管生成方面：EGFR协同EGF具有促进神经再生的功能，研究证实激活EGFR可增加神经前体细胞的增殖和存活，减少缺血性脑损伤［19］。HIF-1α是调节机体免疫和炎症的关键转录因子，其表达和活性受到细胞氧浓度与EGFR的严密调控，并通过控制血管生成来调节氧的运输能力，增强机体对低氧的耐受［20］。VEGFA为HIF-1α的下游基因，在脑损伤和缺氧的双重刺激下，通过诱导血管生成、进行血供重建而提高神经保护［21］。故推测醒脑静注射液减轻ACI和ACH神经系统损害的机制可能与调节HIF-1α/VEGFA通路促进脑梗死后血管新生、修复受损血脑屏障有关。2）细胞凋亡方面：Caspase-3是涉及细胞凋亡的半胱天冬酶家族成员，已被公认为神经元凋亡的关键介质［22］。JUN可调节炎症反应和细胞凋亡，加重脑缺血/再灌注过程诱导的损伤［23］。此外，STAT3和AKT1与脑卒中后神经元细胞凋亡亦有着密切关系［24］。3）炎症反应方面：ACI早期免疫系统激活诱发炎症细胞的积累和炎性细胞因子（IL-6、TNF、IL-1β、MMP-9）的释放，是导致神经元凋亡、神经系统受损的主要因素［25］。此外，大脑中PTGS2是合成前列腺素的核心酶介，后者介导神经源性炎症反应同时，使脑血管过度扩张引发疼痛［26］。以上核心作用靶点表明醒脑静注射液可能通过促血管生成、抗细胞凋亡、抗炎症反应等机制发挥中药多靶点“异病同治”的特性。

进一步运用GO及KEGG富集分析发现，相关靶点富集通路与动脉粥样硬化密切相关，而动脉粥样硬化是ACI和ACH发生、发展最重要的病理生理机制，亦为独立危险因素［27］。早期机体脂质代谢障碍、纤维组织增生、钙沉积，致使动脉血管内膜增厚，从而形成动脉粥样硬化斑块，病变继续加重则可出现斑块钙化、粥样溃疡、血栓形成和斑块内出血等继发病变，导致颅内动脉狭窄、堵塞或破裂［28］，引发ACI和ACH病理改变。可见脂质代谢异常是动脉粥样硬化的基础，而流体剪切应力则代表血流施加在血管内皮的摩擦力，其下降是动脉粥样硬化和血管炎症的促成条件［29］。随着动脉粥样硬化斑块面积的不断增加，ACI、ACH病情严重程度与复发风险亦增加，故现代医学多采用脑卒中后强化降脂治疗的策略。此外，其他途径如MAPK家族的信号通路可以被各种炎症、损伤、应激等激活，在ACI和ACH炎症反应、神经退行性病变和神经细胞凋亡过程中均发挥重要的作用［30-32］，已被视为缺血性和出血性脑血管疾病的潜在治疗靶点；神经细胞凋亡信号通路的激活会导致神经元丧失，被认为是继发性脑损伤的主要病理变化之一，造成神经功能损伤进行性发展［33］；TNF信号通路、IL-17信号通路介导的神经炎症反应在ACI和ACH病程进展中一方面能够损伤血管内皮细胞，促使动脉粥样硬化及不稳定斑块的破裂，另一方面增加血脑屏障通透性，导致脑水肿及组织坏死，并致预后不良［34］。

基于以上认识，近年来，阻断相关通路的药物一直是ACI和ACH药效机制研究的热点，值得注意的是，本研究发现醒脑静注射液可能通过调节脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化及炎症相关通路从而修复受损的血管内皮系统，减轻血管炎症反应与氧化应激反应，抑制脑损伤的进展，为ACI和ACH神经保护扩展新的治疗手段。

4  小  结

综上所述，通过网络药理学方法初步探究醒脑静注射液“异病同治”ACI和ACH的分子生物学机制，发现醒脑静注射液可能通过槲皮素、栀子苷、桑色素、青蒿素和山柰酚等主要活性成分，作用于VEGFA、JUN、STAT3、IL-6、TNF、ALB、CASP3、AKT1、MAPK3、HIF-1α、EGFR、EGF、PTGS2、IL-1β、MMP-9等核心靶点，涉及脂质与动脉粥样硬化、MAPK信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、凋亡、IL-17信号通路等多条通路，发挥抗氧化应激、抗炎症反应、抗细胞凋亡和促血管生成的作用，从而实现对ACI和ACH脑损伤的保护与修复，具有多成分、多靶点、多通道协同作用、异病同治的特点。

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（收稿日期：2023-02-17）

（本文编辑王丽）