麝香通心滴丸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制

李蒙 刘用 张健真 郝学增 张立晶

摘要  目的：观察麝香通心滴丸预处理对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤后心肌细胞和血管的保护作用及潜在机制。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、I/R组、麝香通心滴丸组（SXTX组）和阳性组，每组15只。SXTX组以18.90 mg/（kg·d）的浓度灌胃；阳性组以尼可地尔1.35 mg/（kg·d）的浓度灌胃；Sham组和I/R组给予等体积去离子水灌胃。各组均灌胃1周后，行冠状动脉前降支结扎-松解手术，除Sham组外其余各组大鼠结扎左冠状动脉前降支30 min后，再灌注120 min，构建心肌I/R模型。通过心肌苏木精-伊红（HE）染色、心肌Masson染色观察大鼠心肌组织及血管改变；电镜观察心肌细胞和血管的超微结构改变；免疫组织化学法观察血管相关蛋白低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）表达情况。结果：与Sham组比较，I/R组大鼠心肌细胞坏死和血管损伤明显，心肌组织中HIF-1α表达增加；与I/R 组相比，SXTX组心肌细胞和血管病理结构损伤减轻，缺血区心肌组织VEGF含量明显增加。结论：麝香通心滴丸预处理可保护大鼠心肌细胞和血管I/R损伤，可能与上调VEGF蛋白表达、促进缺血区微血管新生有关。

关键词  缺血/再灌注损伤；麝香通心滴丸；保护作用；低氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.008

Protective Effect  of Shexiang Tongxin Dropping Pill Pretreatment on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LI Meng， LIU Yong， ZHANG Jianzhen， HAO Xuezeng， ZHANG Lijing

Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

Corresponding Author  ZHANG Lijing， E-mail： dzmyyccu@163.com

Abstract  Objective：To observe the protective effect  of Shexiang Tongxin Dropping Pills on myocardial cells and blood vessels after myocardial ischemia-reperfusion（I/R） injury in rats.Methods：Sixty male SD rats were randomly divided into sham operation group（Sham group），I/R group，Shexiang Tongxin Dropping Pills group（SXTX group），and positive control group，with 15 rats in each group.The rats in SXTX group were given SXTX 18.90 mg/（kg·d） by gavage，and the rats in positive control group were given nicorandil 1.35 mg/（kg·d） by gavage.The rat in Sham group and I/R group were given the same volume of deionized water by gavage.After one week of gavage，the rats left anterior descending coronary artery was ligated for 30 min and then reperfused for 120 min to build the myocardial I/R model except for the Sham group.The changes of myocardial tissue and blood vessels in rats were observed by myocardial hematoxylin-eosin（HE） staining and myocardial Masson staining.The ultrastructural changes of cardiomyocytes and blood vessels were observed by electron microscope.The expressions of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α） and vascular endothelial growth factor（VEGF） were observed by immunohistochemistry.Results： Compared with Sham group，the myocardial cell necrosis and vascular injury of the rats in I/R group were obvious，and the expression of HIF-1α in the myocardial tissue  increased.Compared with I/R group，the myocardial cell and vascular pathological structural damage in SXTX group  alleviated，and the protein expressions of VEGF in the ischemic area  significantly increased.Conclusion：Shexiang Tongxin Dropping Pills pretreatment can protect myocardial cells and vascular I/R injury in rats，which may be related to the up-regulation expression of VEGF protein and the promotion of microangiogenesis in ischemic areas.

Keywords     ischemia/reperfusion injury; Shexiang Tongxin Dropping Pills; protective effect; hypoxia-inducible factor-1α; vascular endothelial growth factor; experimental study

基金项目  2021年度北京中医药大学新教师启动基金项目（No.2021-JYB-XJSJJ057）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（No.2020-YJB-ZDGG-116）

作者单位  1.北京中医药大学东直门医院（北京 100700）；2.北京中医药大学

通讯作者  张立晶，E-mail：dzmyyccu@163.com

引用信息  李蒙，刘用，张健真，等.麝香通心滴丸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（2）：250-253.  急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是心血管疾病的最危重类型之一，其发病急、预后差、病死率高，是急性心源性致死性疾病的主因。无论是药物溶栓、冠状动脉支架植入，还是冠状动脉旁路移植术，再灌注治疗都是其必然过程［1］。然而，心肌再灌注过程本身可诱导心肌细胞损伤、坏死进一步加重，这一过程即为缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤［2］。因此，预防和治疗再灌注损伤尤为关键。麝香通心滴丸由《太平惠民和剂局方》中至宝丹衍生而来，具有芳香益气通脉、活血化瘀止痛的功效。前期研究发现麝香通心滴丸对经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后慢血流病人的有效性及安全性较好［3］。关于麝香通心滴丸对I/R后心肌细胞和血管的保护作用及作用机制尚未明确。本研究通过构建I/R损伤大鼠模型，观察麝香通心滴丸预处理对大鼠心肌I/R损伤后心肌细胞和血管的保护作用，以及对低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，进而探讨其保护I/R的潜在作用机制，为麝香通心滴丸防治I/R的临床应用提供实验依据。

1  材料与方法

1.1  实验材料

1.1.1  实验动物

无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠60只，9～10周龄，体质量（250±10）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。实验操作通过北京中医药大学东直门医院动物伦理的要求，伦理号（No）：21-49。

1.1.2  实验药物

麝香通心滴丸，规格：35 mg，批准文号：国药准字Z20080018，由内蒙古康恩贝药业有限公司提供，以去离子水配成［18.90 mg/（kg·d）］溶液，超声溶解，高压灭菌后于－20 ℃贮存备用。 尼可地尔片，规格：每片5 mg，批准文号：国药准字H20160540，由Nipro Pharma Corporation Kagamiishi Plant生产，使用去离子水配制成1.35 mg/（kg·d）的混悬液保存备用。

1.1.3  实验试剂及仪器

实验试剂：苏木素染液（武汉市皮诺飞生物科技有限公司生产），HIF-1α抗体（28b）（Santa，sc-13515-200 μg/mL），VEGF Rabbit Polyclonal Antibody（proteintech，19003-1-AP-150 μL），过氧化氢溶液（国药集团化学试剂有限公司生产，10011218），牛血清白蛋白（BSA）（Solarbio，A8020），包埋液（环氧树脂Epon812），二抗［辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔/鼠通用二抗］（DAKO，K5007），组化试剂盒二氨基联苯胺（DAB）显色剂（DAKO，K5007）。

实验仪器：超薄切片机（徕卡ULTRACUT R），光学显微镜（CIC，XSP-C204），透射电镜（日本日立H-7650），正置光学显微镜（日本尼康），成像系统（日本尼康）。

1.2  实验方法

1.2.1  动物造模

对SD大鼠进行冠状动脉前降支结扎松解手术构建心肌I/R模型。将SD大鼠以4%戊巴比妥钠（0.4 mL/100 g）腹腔麻醉注射，之后气管插管，接动物呼吸机和心电图机，于左侧第三肋与第四肋间切开皮肤，钝性分离肌层，打开胸腔，充分暴露心脏，用带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间，于左心耳根部下方约2 mm处进针，将左前降支连同少量的心肌组织一起结扎，先缺血30 min、再灌注120 min制备大鼠心肌I/R模型。抬高的ST段下降1/2以上为大鼠心肌I/R模型造模成功。

1.2.2  分组及给药

适应性喂养1周，采用随机数字表法将60只SD大鼠随机分为4组：假手术组（Sham组）、I/R组、麝香通心滴丸组（SXTX组）和阳性组，每组15只。所有用药剂量按照人与大鼠体表面积换算，SXTX组按成人用量的2倍，给予麝香通心滴丸18.90 mg/（kg·d）灌胃，阳性组以尼可地尔1.35 mg/（kg·d）灌胃，Sham组和I/R组给予等体积去离子水灌胃。每日1次，连续灌胃1周，末次灌胃1 h后构建大鼠I/R模型。

1.3  观察指标

1.3.1  心肌苏木精-伊红（HE）染色

实验结束后取出心脏，立即将10%多聚甲醛溶液50 mL注入离体心脏主动脉内，5 min后将左心室前壁心肌组织中间层切成条状，放在上述固定液中固定48 h后，蒸馏水清洗、梯度乙醇脱水，后制作病理切片，切片厚度为4 μm，脱蜡、复水后行HE染色，封固，光镜下观察大鼠心肌组织及血管改变。

1.3.2  心肌Masson染色

取出甲醛中固定24 h后的心肌组织，按乙醇浓度由低至高脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡后蒸馏水水洗。Weiger氏铁苏木素染色5～10 min后流水充分水洗，再用1%的盐酸乙醇分化，再用丽春红酸性品红染液染色5～10 min后用蒸馏水水洗，加1%磷钼酸水溶液5 min，后苯胺蓝液复染5 min，随后1%冰醋酸即刻洗涤后用95%乙醇多次脱水，后置于二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察心脏组织纤维化情况。

1.3.3  电镜观察心肌血管内皮细胞超微结构

留取再灌注末左心室梗死周边缺血区心肌体积约1 mm3的标本，放置于4%戊二醛内固定，0.1 mol/L二甲膦酸钠缓冲液漂洗，1%四氧化锇固定，然后梯度丙酮脱水，使用环氧树脂进行包埋、聚合，制作超薄切片，最后用醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色，在透射电镜下观察并拍照。

1.3.4  免疫组织化学法检测血管相关蛋白HIF-1α、VEGF的表达情况

取10%甲醛固定梗死周边缺血区心肌组织，并进行常规石蜡包埋及心肌切片（5 μm），石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，3%牛血清白蛋白室温封闭30 min，加一抗（HIF-1α 1∶50稀释，VEGF 1∶200稀释），4 ℃孵育过夜，加HRP标记山羊抗兔二抗孵育30 min，DAB显色，复染细胞核，脱水封片，光镜下分别观察HIF-1α、VEGF蛋白的表达情况。

1.4  统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用 Tamhane′s T2 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1  HE染色结果

Sham组心肌组织结构正常、完整，心肌细胞分布均匀、有序，轮廓清晰可见，胞核与胞质边缘分明，血管管腔完整。I/R组心肌组织染色着色较浅，有细胞轮廓不清及破碎现象，组织排列异常紊乱、呈无序状，并伴有炎性细胞浸润，坏死区充血出血。阳性组心肌细胞部分相互连接，排列整齐，心肌细胞形态正常，心肌纤维中少量心肌纤维变性坏死及脂肪变性，伴少量炎性细胞浸润。与I/R组比较，SXTX组心肌组织排列较为整齐，着色相对更均匀，有炎性细胞浸润，血管管腔完整度较好。详见图1。

2.2  Masson染色结果

Sham组Masson染色心肌纤维无纤维化，仅在血管壁周边有着色。I/R组显示紫红色的心肌组织明显减少，存在大量呈蓝色的胶原纤维，血管破碎，部分血管呈管腔狭窄和闭合。与I/R组相比，阳性组、SXTX组Masson染色显示以紫红色心肌组织为主，蓝色胶原纤维增生沉积现象显著减轻。详见图2。

2.3  透射电镜观察心肌血管内皮细胞超微结构

Sham组微血管基底膜未见增厚，内弹性膜未见变窄，管腔规整，内皮细胞排列整齐，内皮细胞胞质和核仁结构清楚，周围心肌细胞形态完整，未见脂质沉积；I/R组内膜下结缔组织肿胀，内弹性膜局部变窄，管腔严重变形，内皮细胞胞质肿胀，可见胞质碎片，核膜部分缺失，周围心肌细胞出现明显损伤，细胞破碎严重，大量的脂质沉积；与I/R组相比，SXTX组微血管基底膜轻度增厚，内弹性膜局部变窄，管腔稍有变形，内皮细胞排列较整齐，可见内皮细胞质和核仁结构，周围心肌细胞形态基本完整，少量脂质沉积。详见图3。2.4  免疫组织化学法检测心肌中HIF-1α、VEGF的蛋白表达

与Sham组比较，I/R组心肌组织中HIF-1α表达增加，提示在缺血、缺氧状态下HIF-1α蛋白反应性增加。与I/R组比较，SXTX组心肌组织HIF-1α表达下降，VEGF蛋白表达增加，提示麝香通心滴丸可促进VEGF蛋白的生成，进而促进缺血区血管形成，改善心肌组织乏氧环境。详见图4、图5。

3  讨  论

“时间就是心肌”，由于心肌组织细胞对缺氧、缺血的敏感性高，尤其是其具有不可再生的特性，因此，在AMI的救治过程中，及时再灌注治疗是挽救濒死心肌细胞的关键。然而缺血再灌注治疗必然会造成再灌注损伤，是AMI不可避免的风险事件。保护心肌I/R损伤可防止心肌梗死后不良重塑和更差的临床结果。研究发现持续的心肌I/R可诱导各种形式的心肌细胞死亡和冠状动脉微血管损伤［4］。

麝香通心滴丸由人工麝香、蟾酥、人工牛黄、冰片、人参茎叶、丹参、熊胆粉组成，具有芳香益气通脉、活血化瘀止痛之功效。多项研究表明麝香通心滴丸可减轻心肌缺血损伤，可能通过升高内源性一氧化氮水平，抑制炎症反应，改善冠状动脉微循环等［5-7］。本研究亦发现麝香通心滴丸可保护心肌I/R引起的心肌细胞和血管损伤。王伟等［8］对麝香通心滴丸组方入血成分进行网络药理学研究，发现VEGF/血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路可能为麝香通心滴丸治疗冠心病的信号通路。本研究结果同样发现麝香通心滴丸可促进缺血区心肌组织VEGF蛋白的生成，并提示可能与HIF-1α介导的信号通路有关。HIF-1α是一种关键的氧敏感转录因子，心肌组织细胞缺血缺氧时，诱导HIF-1α表达增加，进而调控多种基因表达，发挥机体对低氧或缺血的保护性适应［9］。VEGF与血管生成密切相关。在心肌I/R损伤中，增加血管生成可有效改善病灶缺氧状态，从而保护心脏［10］。本研究发现心肌I/R损伤时HIF-1α的表达增加以适应乏氧环境，麝香通心滴丸可能通过促进VEGF蛋白的生成，促进缺血心肌血管新生，改善乏氧环境，参与大鼠心肌I/R心肌保护的过程。

综上所述，麝香通心滴丸可有效保护大鼠心肌I/R的细胞和血管损伤，减轻心肌组织病理损伤，其作用机制可能与上调心肌组织VEGF蛋白的表达及促进缺血区微血管新生有关，从而达到保护心脏、抗心肌

I/R损伤的作用。

参考文献：

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［3］  韩松洁，张晓雨，张立晶，等.麝香通心滴丸对PCI术后患者慢血流的临床证据评价［J］.世界科学技术-中医药现代化，2018，20（10）：1772-1777.

［4］  HEUSCH G.Myocardial ischaemia-reperfusion injury and cardioprotection in perspective［J］.Nature Reviews Cardiology，2020，17（12）：773-789.

［5］  张艳达，施珊岚，厉娜，等.麝香通心滴丸改善心肌梗死小鼠微循环障碍的作用机制［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2017，15（23）：2969-2972.

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［7］  王华伟，金丹丹，潘海华.麝香通心滴丸通过p-Akt/p-GSK3β/GSK3β通路对心肌梗死小鼠的心肌保护作用研究［J］.中国中医药科技，2020，27（3）：352-355.

［8］  王伟，刘星雨，尚云龙，等.基于血清药物化学与网络药理学探究麝香通心滴丸治疗冠心病的机制［J］.中成药，2020，42（10）：2768-2777.

［9］  ZHENG J，CHEN P E，ZHONG J F，et al.HIF-1α in myocardial ischemia-reperfusion injury（review）［J］.Molecular Medicine Reports，2021，23（5）：352.

［10］  LI J，ZHOU W J，CHEN W，et al.Mechanism of the hypoxia inducible factor 1/hypoxic response element pathway in rat myocardial ischemia/diazoxide post conditioning［J］.Molecular Medicine Reports，2020，21（3）：1527-1536.

（收稿日期：2022-03-31）

（本文编辑王丽）