基于数据挖掘和网络药理学探讨叶天士治疗胸痹心痛病的用药规律❋

颜梦凡,李鑫辉,刘泳钊,李彩云,蒋 啸

(湖南中医药大学中医学院,长沙 410208)

叶桂(1667—1746),字天士,号香岩,清代著名医学家,“温病四大家”之一。叶天士毕生专注临床研究,亲笔著述的医案并不多,所传于世者,多为其门人、后裔纂辑。《叶天士医学全书》所辑医书13部,辑录叶天士对温病学理论的阐释及其丰富的临床经验,广泛涉及内、外、妇、儿、五官等各科。

胸痹心痛病是以胸部闷痛、喘息不得卧为主症的疾病,甚者心痛彻背,背痛彻心[1],属于西医所指“冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性心脏病、心绞痛”等范畴[2-3]。东汉张仲景在《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治第九》中论述“夫脉当取太过不及,阳微阴弦,即胸痹而痛,所以然者,责其极虚也。今阳虚知在上焦,所以胸痹、心痛者,以其阴弦故也”[4],首次明确胸痹的病名,提出“阳微阴弦”是其基本病机。叶天士对胸痹心痛病的理解是基于张仲景思想的继承与发展,但因其设“胸痹”“心痛”专篇医案较少,其余医案分散,又多伴随其他症状,收集难度较大等原因,鲜少有人系统整理分析叶天士治疗胸痹心痛病的医案,本文将收集整理《叶天士医学全书》中有关胸痹心痛病的医案,分析其中用药规律,期望能从中找出叶天士治疗胸痹心痛病特有的学术思想,以启发现代临床治疗胸痹心痛病遣方用药的思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源与筛选

本次医案资料选自中国中医药出版社出版、黄志英主编的2015年3月第二版《叶天士医学全书》[5]中《临证指南医案》《种福堂公选医案》《叶氏医案存真》《叶天士晚年医案真本》《眉寿堂方案选存》《未刻本叶天士医案》。此6本书为数据来源,其中《临证指南医案》第十卷为《幼科要略》,未纳入数据整理范围。

从《叶天士医学全书》中所选的6本书籍共载医案数千例,按以下纳入标准和排除标准筛选,通过手工检索、录入、复核的方式,最终筛选出100首符合标准的方剂。

1.2 纳入标准

在方剂功效主治中依据检索词“胸痹”“心痛”“心痛引背”“背痛彻心”“胸痛”进行检索;病案中方剂有完整药物组成;首诊与复诊处方所属医案独立;重复医案取一则;剂型包括汤剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂。

1.3 排除标准

检索词为“胸痞”“胸胁痛”“胸脘痛”等;药物罗列不全或未给出完整方剂的医案;重复医案。

1.4 数据规范

本次数据整理所选的医案部分缺乏对方药名称的规范化统一,带有别名、年代和叶天士的学术特色,故参照2020年版《中华人民共和国药典》(一部)[6]规范中药名称,如“广皮”规范名称为“陈皮”,“小茴”规范名称为“小茴香”,“官桂”规范名称为“肉桂”,“炒桃仁”规范名称为“桃仁”等;未标注炮制方法的药物,皆归为生品,如“甘草、白芍、半夏”等;对于未列出完整药物组成的方剂,参照《叶天士医学全书》中《临证指南医案集方》将药物组成补充完整。

1.5 数据赋值与录入

数据使用二分类赋值法,运用Excel 2021软件将出现的中药列为1,未出现的列为0,构建原始数据库。参照《中华人民共和国药典》和“十三五”规划教材《中药学》[7],按中药名称、药性、药味、归经、功效作为类别收录整理,存在的计为1,不存在的计为0,建立数据矩阵模型。为保证数据的准确性,此次数据挖掘由2位研究人员进行数据录入与核对。

1.6 统计方法

采用Microsoft Excel 2021软件,利用频次统计方法,对数据库中高频中药(频次≥8次)名称,药性、药味、归经和功效等变量分布情况进行统计分析,构建三线表,使用Origin 2022软件制作相应的频次雷达图。

采用SPSS Modeler 18.0软件的Apriori算法进行关联规则分析,构建药物关联规则网状图。

采用SPSS 25.0对高频中药进行聚类分析和因子分析,绘制聚类图并提取载荷较高的公因子。

1.7 网络药理学研究

1.7.1 核心药物组合半夏-生姜-茯苓的活性成分和预测靶点筛选 在BATMAN-TCM[8]网站中分别以“BAN XIA”“SHENG JIANG”“FU LING”为检索式,调整“Score cutoff=80”“AdjustedP-value=0.05”,获取每味中药的活性成分和潜在作用靶点,排除重复靶点。

1.7.2 胸痹心痛病的相关靶点筛选 分别以“angina pectoris”“ischemic heart disease”“coronary heart disease”“chest pain”“heartache”为检索式,在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)、DrugBank数据库(https：//www.drugbank.ca/)、OMIM数据库(https：//www.omim.org/)、TTD数据库(https：//db.idrblab.net/ttd/)中获取疾病的相关靶点,合并并删除重复靶点。

1.7.3 获取核心药物组合与疾病的相关靶点 使用Venny2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取核心药物组合半夏-生姜-茯苓与胸痹心痛病的交集靶点,并绘制韦恩图。

1.7.4 疾病相关靶点的相互作用和核心靶点的筛选 将1.7.3获取的交集靶点导入STRING网站(https：//string-db.org),设置生物体是“Homo sapiens”,预测靶蛋白的互作关系(protein-protein interaction,PPI)。通过软件Cytoscape3.9.1中“Analyze Network”功能对从1.7.3获得的靶点进行拓扑属性分析,Degree值取中位数进行可视化展示,寻找核心靶点。

1.7.5 通路富集分析 利用1.7.3获得的靶点,采用Metascape网站(https：//metascape.org)进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析,设置物种为H.sapiens,富集靶点大于3,P<0.01,各取生物过程(biological process,BP),细胞组成(cellular component,CC),分子功能(molecular function,MF)结果的前10位,应用微生信网站(www.bioinformatics.com.cn)做BP、CC、MF三合一图。以KEGG通路结果的Gene In GO And Hit List降序排列,取前20位,应用微生信网站做富集气泡图。

2 结果

收录的6本医籍中符合标准的处方共100首,涉及中药169味,中药使用总频次为655次。其中,茯苓的使用频次为45次,是使用频次最高的药物,用方率占45%,用药率占6.87%。将本次数据挖掘中单味中药使用频次≥8次的中药作为高频中药,分别是茯苓、半夏、桂枝、生姜等,共计20味,累计使用频次300次,占总中药使用频次的45.8%,具体结果见表1。

表1 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药频次表

2.1 高频中药药性和药味分析结果

对纳入标准的高频中药药性和药味进行统计分析,一味中药有多种性味,则全部统计在内。高频中药药性分为温(6味,30%),微温(3味,15%),平(5味,25%),寒(4味,20%),微寒(2味,10%)5种。高频中药药味分为苦味(11次,35.48%),甘味(10次,32.26%),辛味(8次,25.81%),酸味(1次,3.23%),淡味(1次,3.23%)。见图1。

图1 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药药性、药味雷达图

2.2 高频中药归经和功效分析结果

依据分类标准,一味中药如果有多个归经,则全部统计在内。高频中药归经分为心经(12次,18.46%),肺经(10次,15.38%),脾经(10次,15.38%),肝经(9次,13.85%),大肠经(7次,10.77%),胃经(7次,10.77%),肾经(6次,9.23%),膀胱经(2次,3.08%),小肠经(1次,1.54%),胆经(1次,1.54%)。高频中药功效分为补虚药(74次,24.67%),化痰止咳平喘药(48次,16%),利水渗湿药(45次,15%),解表药(44次,14.67%),清热药(26次,8.67%),理气药(24次,8%),活血化瘀药(23次,7.67%),化湿药(8次,2.67%),安神药(8次,2.67%)。见图2。

图2 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药归经、功效雷达图

2.3 高频中药的关联规则分析结果

设置最小规则置信度≥60%,最低条件支持度≥7%,最大前项数是5,获得常用药物组合11项。所得药物组合由3味药组成的有3项,由2味药组成的有8项,具体结果见表2。其中,中药使用频次与点的大小呈正相关,用线条粗细深浅表示药物关联强弱程度。见图3。

图3 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药配伍网络图

表2 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药关联规则分析结果

2.4 高频中药聚类分析结果

以横向聚类图展示,当截距为21,聚为5类时,各类别中药基本达到稳定。聚类分析结果见表3,聚类谱系图见图4。

图4 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药聚类分析图

表3 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药聚类分析结果

2.5 因子分析结果

选用Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)取样适切性量度和巴特利特(Bartlett)球形度检验辨别样本是否适合进行因子分析,对使用频次≥8次的20味高频中药降维分析,得出KMO值为0.550,Bartlett球形度检验近似卡方值为389.384,自由度为190,显著性P<0.001,提示各变量间具有较强的相关性,可以进行因子分析。

采用主成分分析,最大方差旋转法提取初始特征值大于1的公因子,使用观测相关系数与偏相关系数,排除小系数,指标大于0.3,提取出符合初始特征值的8个公因子,具体结果见表4。绘制因子载荷图和碎石图。见图5。

图5 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药因子分析的载荷图与碎石图

表4 叶天士治疗胸痹心痛病的高频中药公因子信息

2.6 网络药理学结果

2.6.1 核心药物组合的活性成分及预测靶点 半夏-生姜-茯苓是关联性最强的一项药物组合,将其作为核心中药分析叶天士治疗胸痹心痛的潜在机制。使用BATMAN-TCM数据库筛选获得半夏的活性成分有22个,生姜的活性成分有67个,茯苓的活性成分有10个,去除1个重复项“Choline”后共得活性成分98个。筛选获得半夏预测靶点256个,生姜预测靶点394个,茯苓预测靶点72个,合并去重后获得核心药物组合半夏-生姜-茯苓靶点共520个。

2.6.2 疾病的相关靶点 设定GeneCards数据库的Relevance score>10,以检索式在上述4个选定的数据库里分别检索,合并4个数据库结果并去重,获得胸痹心痛病相关靶点共4 322个。

2.6.3 核心药物组合与疾病交集靶点 将核心药物组合半夏-生姜-茯苓的520个靶点与胸痹心痛病的4 322个靶点取交集,见图6。获得交集靶点205个,此为核心药物组合半夏-生姜-茯苓治疗胸痹心痛病的关键靶点。

图6 核心药物组合-疾病的共同靶点韦恩图

2.6.4 疾病相关靶点的相互作用和核心靶点筛选结果 将2.6.3得到的205个靶点导入STRING网站,PPI分析包括204个节点,1 668条边,平均节点度是16.4,平均局部聚类系数是0.464,PPI富集P<0.001,提示靶点间相互作用较强。获取共同作用靶点的PPI网络图,见图7。将PPI网络作用关系结果导入Cytoscape3.9.1,由图8可知,Degree值排名前3的核心靶点分别是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、FOS原癌基因(fos proto-oncogene,FOS)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)3,其中Degree值最高的是TNF。

图7 核心药物组合治疗胸痹心痛病共同作用靶点的蛋白互作网络图

图8 核心药物组合治疗胸痹心痛病的靶蛋白互作关系图

2.6.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析结果 GO功能富集结果得出BP共1 268个条目,主要涉及调节血液循环(regulation of blood circulation)、心脏收缩的调节(regulation of heart contraction)、心率调节(regulation of heart rate)、心肌细胞收缩(cardiac muscle cell contraction)等; CC共126个条目,主要涉及跨膜转运复合物(transmembrane transporter complex)、质膜蛋白复合物(plasma membrane protein complex)、钙通道复合物(calcium channel complex)、肌纤维膜(sarcolemma)等; MF共207个条目,主要涉及单原子离子门控通道活性(monoatomic ion gated channel activity)、单原子离子跨膜转运蛋白活性(monoatomic ion transmembrane transporter activity)、被动跨膜转运蛋白活性(passive transmembrane transporter activity)等。BP、CC、MF按排序结果各选取前10条,见图9。

图9 核心药物组合靶点的GO功能富集分析图

KEGG通路富集结果得出171个条目,核心药物组合靶标基因显著富集在钙离子(calcium,Ca2+)和环状鸟苷单磷酸酯-蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G,cGMP-PKG)等信号通路。按排序条件选取前20条,见图10。

图10 核心药物组合靶点的KEGG信号通路富集分析气泡图

3 讨论

《叶天士医学全书》集叶天士所编著的医学著作于一体,纵观其记载的胸痹心痛篇诸案,可见叶天士勤求古训,博采众长,学习张仲景宝贵治疗经验并加以继承和发扬,守“阳微阴弦”之病机,以温通之法消散阴痹,同时重视脏腑间功能协调。本文基于上述数据挖掘结果,对用药规律进一步讨论,分析新处方组方特色,同时运用网络药理学探讨核心药物组合的潜在通路和靶点,具体结果如下。

用药频次统计显示,使用频次最高的是茯苓。茯苓有利尿、降血脂、调节胃肠道功能的作用,常被用于治疗水肿、痰饮、心悸、心衰和脾虚泄泻等疾病[9]。细胞凋亡、炎性因子大量释放是心肌缺血的重要发生机制[10],而茯苓中的茯苓酸成分有抑制细胞凋亡的功能,桂枝茯苓丸组合方的活性成分能有效抑制炎性因子的释放[11-13],并且此方中的主要成分桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁皆是本次数据挖掘的高频中药。高频中药的药性多为温、平,甚少使用大寒、大热之品,药味多甘、苦、辛之品,甘能补、能和缓,苦能燥湿、能泄降气逆,辛能行气血、能发散。入心、肺、脾经药物最多,功效多为补虚、化痰止咳平喘、利水渗湿等。叶天士认为“若夫胸痹,则但因胸中阳虚不运……惟流运上焦清阳为主”。这一观点继承了张仲景“阳微阴弦”的思想,因此在用药上多使用了桂枝、薤白、生姜、人参这类温阳补气的药物来改善心气不足或心阳亏虚时出现的胸痛症状。这既反映了叶天士治疗胸痹心痛病用药多温补、避免攻伐之性的特色,也与胸痹心痛病的主证和本虚标实的病机相符合。《灵枢·本藏》记载“肺大则多饮,善病胸痹,喉痹,逆气”,证实胸痹与肺中水饮有关,水湿停聚,上犯心肺,气行失畅,发为胸痹[14],故用半夏、瓜蒌、茯苓、厚朴化痰散结,行气祛湿。血脉痹阻,不通则痛,叶天士喜用“活血化瘀法”,桃仁、延胡索、当归等药物是养血活血、行气止痛之品,现代药理学证明此类药物能改善心肌缺氧、扩张血管、抗血小板凝集、降低心绞痛的发作频率[15]。叶天士治疗胸痹心痛病不仅考虑阳虚证候,亦兼顾阴虚之象。若肾阴亏虚,不能濡养五脏之阴,水不涵木,心肝火旺,损伤心阴,心脉失于濡养,亦可导致胸痹,因此叶天士常用枸杞子、地黄、白芍、甘草、人参等药物益气养阴,滋补肝肾。

关联规则分析发现3味药组成的药物组合半夏-生姜-茯苓的关联性最强,2味药组成的药物组合半夏-生姜关联性最强。半夏、生姜和茯苓这3味药在《伤寒杂病论》中被视为心系病证的通用药[16],半夏和生姜组成了“小半夏汤”。孙思邈《千金要方》卷十小半夏汤条方后附记记载“有人常积气而死,其心上暖,以此半夏汤少许汁入口中遂活”,此积气即为孙思邈对胸痹的一种称呼,“积气而死”指的是胸痹发作濒临死亡,煎服小半夏汤后则可得救。此外生姜可以制约半夏毒性,二者配伍,以半夏为主药,生姜为辅药,若加入茯苓,则为小半夏加茯苓汤的组方,有加强燥湿化痰、降逆止呕的功效,故此方常被使用在心脏移植术后减轻心脏损伤[17]。

聚类分析可以得出5类药物组合,根据功效能总结为3首新处方。C1(半夏,生姜,苦杏仁,厚朴,薤白,瓜蒌,茯苓)是瓜蒌薤白半夏汤合小半夏加茯苓汤的化裁方,有通阳散结、祛痰宽胸的功效。C2(白芍,甘草,桂枝)+C4(川楝子,延胡索,桃仁),方中桂枝和甘草温心阳,白芍、川楝子、延胡索和桃仁养血活血,化瘀止痛。C3(人参,黄连)+C5(当归,柏子仁,枸杞子,牡丹皮,地黄)是柏子养心汤合清胃散的化裁方,有补气养血、养阴安神、清脏腑热的功效。

因子分析与聚类分析结果大致相同,共得到8个公因子,根据功效总结为3首新处方,F1(生姜,半夏,苦杏仁,厚朴,薤白)+F6(人参,瓜蒌)+F7(茯苓)为瓜蒌薤白半夏汤合厚朴生姜半夏甘草人参汤化裁,主通阳散结,健脾消满,祛痰宽胸;F2(延胡索,川楝子,桃仁)+F3(甘草,白芍,桂枝)主养血活血,疏肝理气,温通止痛;F4(枸杞子,当归,柏子仁)+F5(地黄,牡丹皮)+F8(黄连)能益气养阴,养血安神。

网络药理学研究结果显示,与本病密切相关的核心靶点是TNF、FOS、NOS3,最核心的靶点可能是TNF。研究发现,TNF在心脏广泛表达[18],TNF为炎性因子,参与炎症反应,它可以调节外周阻力和心脏收缩力,当冠心病症状改善时,TNF水平降低[19-20]。NOS3又称一氧化氮合酶3,已被证实多与冠心病发病有关[21]。核心药物组合半夏-生姜-茯苓治疗胸痹心痛病的相关靶点显著富集的信号通路是钙离子信号通路和cGMP-PKG信号通路。Ca2+是心肌细胞收缩过程中关键的离子电流,与体内多种钙离子信号通路紧密结合[22]。研究表明,钙通道阻滞剂能明显缓解冠状动脉痉挛,减轻心绞痛,改善心肌梗死[23]。cGMP由鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,GC)产生,通过激活下游PKG靶向各种分子来调节心肌细胞中的细胞功能,能有效治疗伴有心力衰竭的冠心病[24-26],同时活化Ca2+激动冠状动脉血管平滑肌上K+通道从而调控血管舒张力[27]。由此可见,核心药物组合半夏-生姜-茯苓可能通过TNF、FOS、NOS3等靶点对钙离子信号通路,cGMP-PKG信号通路进行调控从而发挥改善胸痹心痛的作用,网络药理学的结果与现代研究的结论一致。

本研究通过数据挖掘《叶天士医学全书》中叶天士治疗胸痹心痛病常用处方,结合网络药理学,分析叶天士治疗胸痹心痛疾病的用药规律,得出叶天士治疗胸痹心痛病多从温阳化痰、活血化瘀、益气养阴3个方面选方用药,通过关联规则分析得出核心药物组合,揭示其潜在靶点和通路,为现代临床使用中药治疗胸痹心痛病提供了新的组方思路。本研究相关医案收集较少,样本量稍显不足,且未记载用药剂量,今后将进一步深入研究。