基于中药网络与靶点网络探究中药治疗糖尿病合并缺血性中风的用药规律与作用机制❋

李清丽,李 浩,谢雁鸣,刘 毅

(1.中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京 100700;2.中国中医科学院望京医院,北京 100102)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)被公认为是缺血性中风(ischemic stroke,IS)发生的独立危险因素,并且DM也会增加其他中风危险因素的发生[1]。DM以血糖缓慢升高为主要表现,病因包括胰岛素分泌受损或/和作用受损[2-3]。中国DM防治指南显示,从2007年到2017年,DM的发生由9.7%上升到11.2%,西医主要运用降糖药或胰岛素进行治疗,仍存在胃肠道反应、水肿等诸多不良反应[4]。IS以脑组织血液灌注不足、脑组织坏死为基础,临床主要表现为肢体活动障碍[5]。我国每年新增300余万IS患者,中风是全球主要的死亡和致残原因,且增加患者的生活负担[6-7]。西医主要通过静脉溶栓、血管内治疗、抗血小板药物进行治疗,但仍不能有效防止IS的复发[8]。

DM合并IS在中医古籍中没有相应的病名,现代医家将其称为“消渴病中风”,二者密切相关,本病起初以消渴为主要表现,逐渐出现中风的症状[9]。经过多年的临床实践,现代医家对DM合并IS的病机有了更深入的见解,中药的综合治疗也取得了安全、有效的成果。但对于有效药物成分、分子作用机制的研究尚不清楚,网络药理学方法可分析药物与药物、药物与疾病之间的关系,被广泛用于中药组方治疗疾病的机制探讨中,本研究收集临床研究有确切疗效的中药复方,通过中药网络与靶点网络探究中医药治疗DM合并IS的组方规律,探索药物有效成分和疾病靶点的关系,以期为后续临床应用提供思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源

检索中国知网(CNKI)、万方 (Wanfang)、维普(VIP)、中国生物医学文献服务系统(SinoMed)四大中文数据库。以“糖尿病”“消渴”“缺血性中风”“脑梗死”“缺血性卒中”“病案”“临床研究”“处方”等为关键词或主题词进行检索,年限为建库至2022年10月3日,根据纳排标准纳入符合要求的文献。

1.2 纳入标准

文献为临床研究或名老中医验案、病案,其中有复诊的病案只录入加减的药物;公开发表的期刊、会议、学位论文等文献;干预措施为口服中药汤剂或组成明确的中药颗粒剂;药物组成清晰,疗效确切。

1.3 排除标准

综述、系统综述、指南、专家共识、动物实验、理论探索等类型文献;中药复方药物组成不明确或信息严重缺失;干预措施为针灸、中药注射液、胶囊制剂等;数据重复发表者,收录数据完整者或发表较前者。

1.4 数据库的建立与数据标准化

运用NoteExpress软件进行文献管理和查重,以双人双录入的方式收录文献相关信息,包括文献题目、研究者、来源、中医证型、治法、中药复方名称和组成,运用Microsoft Excel 2016建立DM合并IS中药复方数据库。参考2020版《中华人民共和国药典》[10]和《中药学》[11]规范中药名称,对存在别名、不同炮制方式、不同药用部位的中药名称进行统一,如川菖、九节菖蒲、富蒲统称为石菖蒲等;若主要功效不同,则保留原名,如地黄和熟地黄等。

1.5 数据统计与分析

将规范处理后的数据录入到古今医案云平台中,对药物出现的频次及药物的属性进行统计;设置置信度为50%,支持度为20%,分析高频药物的关联性;筛选前20个中药,采用欧氏距离,最长距离法进行群集分析;对高频药物构建复杂网络,挖掘中医药治疗DM合并IS的核心组方。

1.6 核心组方药物成分的获取与靶点筛选

在TCMSP(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库检索所得的药物成分,选择口服生物利用度 (oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness,DL)≥0.18的部分,收集药物的成分和相应的靶点,并汇总于表格中。对于TCMSP数据库中没有检索到的中药,其主要有效成分通过查阅中国知网相关文献获得,并利用Pubchem数据库、SwissADME(http：//www.swissadme.ch/)、SwissTargetPrediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平台查找结构、预测作用靶点。之后利用Uniprot(http：//www.uniprot.org/)数据库,筛选智人(homo sapiens)、已经证实的(reviewed)靶点,并规范靶点所对应的基因名称,与收集的药物成分作用靶点匹配,并对靶点进行去重。

1.7 DM合并IS疾病靶点的获取

借助Genecards(https：//www.genecards.org/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//www.omim.org/)数据库检索“diabetes”“ischemic stroke”获取疾病靶点。将两疾病靶点汇总后剔除相同的部分,与Uniprot数据库人类已验证过的基因靶点相对比后取相同的部分,得到DM合并IS疾病的靶点。

1.8 疾病-药物-成分-共有靶点网络构建

将以上得到的药物成分靶点和DM合并IS疾病靶点取共有部分得到共有靶点,以疾病、核心组方、各中药、药物成分和共有靶点为网络中的一点,其之间的联系为边,运用Cytoscape3.9.1软件,构建相互作用网络;进一步分析网络,以度值(degree)≥60为条件,筛选药物有效成分。

1.9 蛋白相互作用网络构建(protein protein interaction,PPI)与关键靶点筛选

将所得共有靶点导入到STRING数据库(https：//cn.string-db.org/)中,设置物种为智人,分析获得蛋白与蛋白相互作用结果,设置所需最低交互分数=0.9,获取数据后通过Cytoscape3.9.1进行结果可视化分析,借助MCODE插件,设置节点度值(degree)=4,节点(node score)=0.3,K-core=3对PPI网络进行聚类分析,以大于度值的二倍中位数为条件筛选每一聚类的关键靶点。

1.10 靶点基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析

将共有靶点导入到Metascape数据库(https：//metascape.org/),选择智人选项,进行GO(生物过程、细胞组分、分子功能)和KEGG富集分析,分别获取相应的结果。

1.11 分子对接验证

将PPI网络中筛选的关键靶点与核心组方有效成分两两进行分子对接,得到相应的结合能。从PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)下载蛋白的结构,从TCMSP数据库下载小分子的结构,利用pymol、Auto Dock Tools 1.5.7软件得到结合能大小,并用R语言制作结合能热图。

2 结果

2.1 中药组方筛选和药物频次统计结果

共检索文献2 527篇,根据文章标题和摘要初步筛选得到371篇,通过纳排标准最终得到文献144篇,处方239首,涉及中药194味,共使用1 878次;其中使用频次≥20次的药物有26味,运用次数最高的黄芪为103次,见表 1。

表1 中医药治疗糖尿病合并缺血性中风高频(频次≥20)中药统计

2.2 药物性、味和归经统计结果

对239首方剂里的194味中药进行性、味、归经的统计,194味中药的药性以温、平、寒为主;药味以甘、辛、苦为主;归经以肝、心、脾、肺经为主,见图 1、图 2、图 3。

图1 中医药治疗糖尿病合并缺血性中风中药药性频次统计

图2 中医药治疗糖尿病合并缺血性中风中药药味频次统计

图3 中医药治疗糖尿病合并缺血性中风中药归经频次统计

2.3 关联规则分析结果

对194味中药进行关联规则分析,选择置信度≥0.55,支持度≥0.20,提升度≥1.65。挖掘出6个潜在药物配伍,共涉及6味中药,按支持度从高到低依次排列,见表 2。

2.4 药物聚类分析结果

基于古今医案云平台对高频中药进行层次聚类,共获得4个大的聚类。聚类一：地龙、黄芪、川芎;聚类二：丹参、葛根、水蛭、石菖蒲;聚类三：地黄、麦冬、桃仁、红花、当归、赤芍;聚类四：甘草、玄参、牛膝、大黄、天麻、茯苓、山茱萸。见图 4。

2.5 复杂网络分析结果

对高频药物进行中药-中药复杂网络分析,以边权重不小于30进行筛选,结合临床和文献研究,芳香之品石菖蒲能够开窍豁痰、醒神益智,在预防和治疗IS后认知功能障碍中取得较好的疗效,故将石菖蒲纳入其中[12-14]。综合以上分析得出治疗DM合并IS的核心组方为赤芍、川芎、丹参、当归、地龙、葛根、黄芪、石菖蒲、水蛭(补阳还五汤加减),高频中药复杂网络展示如下,见图 5。

图4 中医药治疗糖尿病合并缺血性中风高频药物聚类分析

图5 中医药治疗糖尿病合并缺血性中风中药的复杂网络展示

表2 中医药治疗糖尿病合并缺血性中风中药关联规则分析

2.6 核心组方药物有效成分获取和靶点收集结果

经过对TCMSP数据库的检索及相关文献的查阅,通过SwissTargetPrediction平台进行靶点的选择,共得到药物成分187个,经过汇总、去重后得到药物靶点1 138个。

2.7 疾病靶点获取结果

通过OMIM、TTD、Genecards数据库得到的DM、IS靶点分别为4 326、1 034个,DM和IS共有靶点为871个。上述靶点取交集后得到靶点299个。

2.8 疾病-药物-成分-靶点网络

运用Cytoscape软件构建疾病-药物-成分-靶点网络,见图 6,网络共包含497个节点(299个靶基因、187个药物成分、9个药物成分、疾病名称和核心处方),5 646条边。筛选度值(degree)≥60的药物成分进行展示,见表3。度值排位较前的成分槲皮素(quercetin)、水蛭素A(hirudinoidine A)、二氢辣椒素(dihydrocapsaicin)、花生四烯酸(arachidonicacid)等为核心组方的有效成分。

图6 糖尿病合并缺血性中风-核心组方有效成分-共有靶点网络图

表3 中药治疗糖尿病合并缺血性中风的高频药物有效成分(度值≥60)

2.9 PPI网络分析结果

将299个共有靶点导入至STRING数据库,获取交集靶点PPI网络,在相互作用的网格中包含299个作用点和1 148条连接线。将得到的数据导入Cytoscape 3.9.1中进行分析,构建PPI网络图,通过MCODE插件分析出3个聚类形式,见图 7,分别以各自的二倍中位数为界值,筛选3个模块的关键靶点,共得到靶点12个。聚类1得到靶点为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)3、转录因子JUN(transcription factor Jun, JUN);聚类2得到靶点为细胞肿瘤抗原p53 (tumor protein P53,TP53)、信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3、SRC原癌基因(SRC proto-oncogene,SRC)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)1、丝裂原活化蛋白激酶又称MAPK1等;聚类3得到靶点为HRAS原癌基因(HRAS proto-oncogene,HRAS)、凝血酶原F2(coagulation factor Ⅱ,F2)等。这些靶点在PPI中具有重要作用,是核心组方药物有效成分治疗DM合并IS的关键靶点。

图7 核心组方有效成分治疗糖尿病合并缺血性中风PPI网络关键靶点筛选流程图

2.10 GO功能及KEGG通路富集分析结果

299个药物疾病共有靶点通过Metascape数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析,见图 8、图 9。通过GO功能分析筛选得到生物过程(biological process,BP),包括对无机物的反应、对激素的反应、循环系统过程等;细胞组分(cellular components,CC)包括膜筏、质膜微区、小腔、膜侧等;分子功能(molecular functions,MF)包括氧化还原酶活性、血红素结合、四吡咯结合等。KEGG富集通路,富集比较明显通路为癌症通路、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products,AGE-RAGE)信号通路、磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/AKT信号通路、环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信号通路等。

图8 核心处方药物对糖尿病合并缺血性中风作用靶点GO分析

图9 核心处方药物对糖尿病合并缺血性中风作用靶点KEGG富集分析气泡图

2.11 分子对接结果

利用Auto Dock Tools 1.5.7对接工具对PPI网络中筛选的关键靶点与核心组方有效成分分别进行分子对接,结合能数值可反映其结合强弱,结合能计算结果见图 10。结合能<0 kcal/mol表明成分与关键靶点在自然状态下可以对接,<-5 kcal/mol表示可以稳定对接。结果显示槲皮素、水蛭素A、花生四烯酸、丹参新酮与MAPK3、TP53、F2等均有较好的对接结果。

图10 核心处方有效成分与关键靶点分子对接结果

3 讨论

大量临床数据表明, IS的发病与DM有着密切的联系[15],国内外研究已证实2型DM合并IS的发病机制与炎性反应、氧化应激反应、内皮受损、血小板凝集、凝血纤溶系统异常及胰岛素抵抗有关[16]。DM合并IS属于中医的“消渴”“中风”,《证治要诀·消渴》篇载“三消久之津血既亏,或目无见,或手足偏废如风疾”[17]。其发生发展的主要病机为气虚阴亏、燥热内盛、煎灼阴津,进而导致血液瘀滞、络脉瘀阻。因此中药在治疗时运用益气养阴、活血通脉的治法, 往往取得较好的疗效[18]。

本研究通过数据挖掘得到中药治疗DM合并IS的核心组方为清代名医王清任的补阳还五汤加减。补阳还五汤以补气活血通络为主要功效,黄芪甘温补一身之气,气旺则血行通畅,祛瘀生新通络;川芎、赤芍、丹参养阴活血祛瘀,水蛭破血逐瘀通经,诸活血药与当归同用活血而不伤血;地龙通经活络,性专善走,引领诸药深入经络;葛根甘凉,增液生津,使阳明津液上承于口;石菖蒲豁痰醒神,益智开窍,防止痰瘀阻络进一步加重病情。诸药合用,符合中药治疗DM合并IS的治则治法。现代药理学认为补阳还五汤可以保护血管功能、减轻炎症,临床研究也证实了补阳还五汤可缓解DM合并IS患者的临床症状[19-20]。

基于中药靶点网络和分子对接分析,补阳还五汤治疗DM合并IS的有效成分包括槲皮素、水蛭素A、二氢辣椒素、花生四烯酸、丹参新酮等。槲皮素可以通过提高一氧化氮(nitric oxide,NO)水平、增强血管内皮细胞功能、清除自由基以抗炎、抗氧化,还能调控MAPK通路,增强胰岛素的敏感性,在DM及脑血管疾病治疗方面发挥巨大优势[21-23]。水蛭素A具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤等多种药理作用,其通过降低血栓素(thromboxane,TXA2)的含量和激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的活性抑制血小板聚集、减轻内皮细胞损伤[24-25]。二氢辣椒素是一种辣椒碱,具有抗氧化应激和抗炎的能力,研究发现,二氢辣椒素能够激动瞬时受体电位香草酸1受体(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1),诱导药物性体温降低,在脑缺血导致的脑损伤中起到保护作用,并且降低活性氧的产生,进而减少脑神经的损伤[26-27]。花生四烯酸在降血脂、抑制血小板聚集、抗炎性物质生成等方面具有自己的优势,研究表明花生四烯酸能够减少白介素6、肿瘤坏死因子、活性氧等炎性物质的产生,可有效逆转2型DM的外周胰岛素抵抗[28-29]。丹参新酮是一种丹参酮类物质,通过发挥抗炎、抗氧化应激的作用抑制脑缺血区神经元的凋亡,促进血管新生,改善DM微血管病变,减轻DM大鼠肾细胞的损伤[30-31]。综上可知,核心组方的多种有效成分具有协同作用,主要通过抗氧化、抗炎、抗血栓、抗胰岛素抵抗、改善内皮功能等作用达到治疗DM合并IS的目的,与中医药配伍理论相一致。

通过PPI网络分析得到核心处方治疗DM合并IS的核心靶点主要包括MAPK3、MAPK1、JUN、TP53、STAT3、AKT1、F2等。MAPK1、MAPK3是丝裂原活化蛋白激酶家族成员,参与机体生长、凋亡、应激适应及细胞炎症等诸多生理、病理过程,研究发现抑制MAPK信号通路,可以抑制多种炎症反应,保护DM大鼠的胰腺组织,又能够抗血小板聚集,保护脑神经细胞[32-33]。JUN是一类蛋白激酶,其中包含c-Jun蛋白,其调控血糖的机制与 MAPK相似,并且当JUN通路被激活时,会降低胰岛素的敏感性[34];刘佩等人发现IS时,神经细胞中的c-Jun表达增加,黄芪的使用可以抑制c-Jun蛋白表达,保护已缺血的脑组织[35]。有研究表明,TP53是一种促细胞凋亡基因,可诱导凋亡和内皮损伤,加重脑损伤,通过抑制TP53的表达,可以减轻小鼠的局灶缺血性损伤;TP53还能在炎症因子的诱导下激活,导致胰岛细胞功能紊乱,促进胰岛素抵抗[36-39]。STAT3参与Janus激酶(janus tyrosine kinase,JAK)2/信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of tranion,STAT)3通路,此通路的激活,能减轻缺血后促炎物质聚集,减少细胞凋亡,加速血管新生[40]。AKT1参与调节血糖、胰岛素抵抗等病理生理过程[41-42];张成发现AKT1可通过磷酸化抑制神经元的凋亡,促进IS后的血管生成,减少脑组织损伤[33]。F2是凝血酶的前体,研究表明DM合并IS的发生与内皮细胞损伤以及凝血纤溶系统异常有关,减少凝血酶的含量可以保护内皮细胞[43-44]。以上基因的表达或抑制跟DM合并IS的病理机制密切相关,推测核心组方或通过对以上靶点的调控发挥治疗DM合并IS的作用。

通过KEGG通路富集分析,发现主要有4条通路与DM合并IS的发生发展过程紧密相关,可能为核心组方发挥治疗作用的关键通路。首先是癌症通路,其通过参与细胞增殖、分化、免疫、炎性反应、血管调节等过程发挥相应的调节作用[45]。AGE/RAGE信号通路已被证明可以直接或间接(通过激活MAPK通路)活化核转录因子(nuclear factor,NF)-κB,增加氧化应激、炎性物质的释放和血栓的形成,加重血管的病变[46-48]。已知PI3K/AKT信号通路参与机体的免疫炎症机制,PI3K/AKT通路激活可以促进脑微血管内皮细胞的形成,PI3K/ATK通路障碍可导致胰岛素抵抗[33,49-51]。cAMP通路已被证实可以影响胰岛B细胞的增殖和凋亡,从而达到抗DM的作用,上调cAMP信号通路可减轻免疫介导的损伤,维持神经元的结构和功能,改善急性脑卒中的预后[52-53]。

本研究通过分析用药数据与构建用药网络,探究中药治疗DM合并IS的组方规律和核心药物,得到的核心组方为补阳还五汤加减;基于中药网络和靶点网络,分析与DM合并IS相关的氧化应激、炎症等分子通路机制信息;最后通过分子对接进一步验证有效成分和关键靶点结合的稳定性。体现了中药复方治疗DM合并IS多成分、多作用部位、多机制的特点,为后续的治疗提供理论依据及参考。由于本研究是基于数据库进行用药组方的规律探讨,临床治疗还需结合病人的个体差异制定个性化的治疗组方。