人体二十二碳六烯酸检测方法的研究进展*

陆佳露,周春艳 综述,余晓丹△ 审校

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心:1.发育行为儿科;2.转化所,上海 200127

二十二碳六烯酸即DHA(C22:6n-3),是一种n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)。n-3 PUFAs为一种碳原子数为18～22个并含有2个及以上双键的PUFAs,因第1个双键出现在碳链甲基端的第3位,所以称为n-3 PUFAs,也叫ω-3 PUFAs。DHA为人体内占比最高的n-3 PUFAs,不仅与婴儿大脑生长和功能发育相关,在维持成人脑功能方面也有重要作用。因此,DHA素有“脑黄金”之称。目前已报道与DHA缺乏相关的疾病包括儿童注意缺陷多动障碍、抑郁症、精神分裂症、孤独症等[1-2]。此外,DHA还具有预防心血管疾病、抗炎、抗癌及免疫调节等功能[3-4]。由此可见,保证人体充足的DHA对于维持其健康至关重要,尤其是在生命的早期阶段。人体DHA主要来源于膳食,如摄入的鱼油、海藻等[5]。另外,人体也可以通过α-亚麻酸(ALA,C18:3n-3)合成DHA。ALA也属于n-3 PUFAs,其作为人体必需的脂肪酸之一同样仅能从食物中获得,但其大部分被氧化用以提供能量,仅有极少部分转化成DHA,可见人体内合成的DHA并不能满足日常生长、发育所需。因此,保证膳食中充分的DHA摄入是预防或改善因DHA不足或缺乏导致相关疾病的最有效方法。事实上,人体不同部位DHA水平不同,用于人体DHA水平检测的方法也多种多样。如何选取最佳的生物标本及合适的检测方法对监测人体DHA水平至关重要。本文对近几年发表的人体内DHA检测方法的文章进行综述,为准确评估人体DHA水平提供依据。

1 人体DHA分布

DHA广泛分布于人体所有器官,其中神经组织大脑和视网膜部位的DHA水平最高[6]。有研究表明,DHA在大脑脂肪酸中的水平为12%～15%[7]。DHA还可酯化成甘油三酯储藏在脂肪组织中,但水平极低。相对于神经组织,DHA在血液中的水平同样较低。血液中的DHA主要分布在血浆中,以及单核细胞、红细胞和血小板等细胞上,其中血浆中的DHA主要酯化成磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇和甘油三酯等,并且与蛋白结合形成脂蛋白。红细胞主要为磷脂形式的DHA。除神经组织、血液和脂肪组织外,DHA还广泛分布在精子、肝脏、脾脏和心脏等部位,因取样困难,一般不作为常规生物标本用于人体DHA水平检测。

中枢神经系统部位的DHA水平最受关注,但因取样困难,极少检测该部位的DHA水平。脂肪组织中DHA周转率较低且不受急性疾病的影响,被视为研究DHA摄入与人体DHA水平变化的最佳选择。相对于脂肪组织,DHA在血浆或红细胞膜中的周转率较快,血浆中为几天或几十天,红细胞膜中为几个月[5]。因此,对短期DHA摄入后人体DHA水平变化的研究,血液标本则应用更广。同时,血液标本还具有取样容易,标本预处理简单等优势。另外,血浆和红细胞中的DHA还是大脑、视网膜、肝脏和其他器官DHA的主要来源。因此,血浆和红细胞磷脂DHA成为研究和分析人体DHA水平的常规生物材料[8]。

2 DHA检测方法

最初,研究者们采用膳食调查法,如食物频率问卷法(FFQ)、24 h膳食回顾法(24HRs)等对个体膳食中摄入的脂肪酸水平进行分析以了解人体血液DHA水平,但该方法存在回忆偏倚等不足,且无法准确反映人体DHA水平。目前主要采用色谱法,如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)等对取自人体的生物材料进行脂肪酸水平检测。色谱法涉及固定相和流动相,当流动相流过加有标本的固定相时,基于待分析物在2个相之间的水平比例不同最终以不同速度移动而互相分离开来。此外,核磁共振技术(NMR)、近红外光谱技术(NIR)等也被用于脂肪酸的检测中。本研究对以上几种方法的原理、优势和局限性进行汇总,见表1。

表1 4种DHA检测方法的原理、优势和局限性

2.1膳食调查法 膳食调查法是调查人群在一定时间内所摄入的能量和各种营养素的数量和质量,以判断个体正常营养需要是否得到满足的方法。目前应用于脂肪酸摄入量评价的有FFQ、24HRs等[9]。

2.1.1FFQ FFQ是通过问卷调查人群在过去限定的某段时间内某些食物的摄入频率或食用量实现对能量或各种营养素摄入量进行计算,分为定性和定量两类。定性FFQ是指某种食物特定时期内所食用的次数,不包括食物量和份额大小;定量FFQ是指某种食物在特定的时期内食用的平均估量,包括食物名称、摄入频率和摄入量信息。FFQ已广泛用于调查饮食和疾病之间联系的流行病学研究中。赵芮等[10]利用FFQ分析了上海市居民 n-3 PUFAs膳食摄入情况,提出上海市18岁以下、18～25岁、>25～60岁、>60岁4个年龄段人群预防心血管疾病的n-3 PUFAs推荐摄入量分别为1 032～2 569、759～3 170、419～3 569、209～3 729 mg/d。SALA-VILA等[11]通过FFQ对DHA摄入水平与携带阿尔兹海默病易感基因的中年人发生阿尔兹海默病的比率进行分析发现,在认知功能未受损的载脂蛋白E-ε4纯合子中,较高的DHA摄入量与较轻的阿尔兹海默症相关的病理改变相关。FFQ虽存在回忆偏倚,但其简单易行、可操作性强且费用较低,适用于评估人群中期或长期膳食摄入情况。

2.1.224HRs 24HRs通过询问调查对象过去24 h实际的膳食摄入情况,对其食物和营养素摄入量进行计算和评价。24HRs成熟、目的明确、易于实施、适用范围广,是目前人群营养调查使用最普遍的膳食调查方法[12]。ZHANG等[13]调取中国健康与营养调查报告中的中国9个省份的15 100名成年人(≥20岁)3 d 24 h膳食报告数据中鱼类或海洋类食物中n-3 PUFAs摄入量,分析与2型糖尿病(T2DM)发生风险的关系,结果显示,当前膳食海洋类来源的n-3 PUFAs摄入量太低(250 mg/d),95%的受试者并不能降低发生T2DM的风险。ZHANG等[13]利用同一批数据,分析n-6/n-3 PUFAs摄入比例与病死率的关系,结果显示,n-6/n-3 PUFAs摄入比例在6～10时可降低病死率[14]。24HRs优点是调查对象负担较小、配合度较高,但同时也存在相应要求,如需要对调查人员进行培训,营养素需要精细计算等。24HRs局限性同样为存在回忆偏倚、不适合记忆不清的老人或儿童、食物份额的重量很难被准确评估,比较适合用于家庭中个体食物消耗状况的调查。在实际运用中,24HRs常与称重法、FFQ等方法相结合以获取更全面的信息。

2.2色谱法 色谱法检测主要分为3个基本步骤:(1)提取标本中的脂肪酸;(2)待分析物的分离并将目标脂肪酸进行硅烷衍生化或甲酯化;(3)待分析物的鉴定和量化。其中步骤(1)为关键步骤,因生物组织中的脂质通常与蛋白质相互作用形成脂蛋白,脂质提取的成功往往决定了后续分析、鉴定和定量的准确程度。

2.2.1TLC TLC是基于待分析物在流动相和固定相(常为硅胶)中存在极性差异,实现对待检测标本分离、鉴定和定量的一种层析分离技术,是最早用于脂质分析的色谱方法。方景泉等[15]采用高效TLC-GC-四极杆质谱联合应用的方法对母乳中的各类脂肪酸水平进行检测,其中DHA水平检出限为2.3 mg/L。GUO等[16]采用TLC-GC研究摄入相应n-3 PUFAs制剂后人体血液(红细胞和血浆)中的二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和DHA的代谢差异。有研究采用TLC-GC研究男性弱精子和正常精子中的PUFAs水平,结果显示弱精子DHA水平明显下降[17]。TLC操作简便、快速、价格便宜、通量高、标本前处理简单,而流动相的多样性可使复杂混合物得到有效分离。但薄层色谱板表面暴露于环境中在短时间内易被氧化而影响使用,精密度和重现性差,分离性能有限。目前TLC主要用于脂质分析前的标本制备并结合LC、GC或质谱技术(MS)等进行标本分析。

2.2.2GC GC的流动相为气体,其原理同样是利用物质在相对运动的2个相中具有不同的分配系数实现对物质的分离和检测。目前用于生物标本中各类脂肪酸检测方法主要包括与MS联合GC(GC-MS)和GC-以火焰离子化检测器(GC-FID)[18]。BROS-KONOPIELKO等[19]采用GC-FID检测孕妇及其孩子血清标本中的n-3 PUFAs和n-6 PUFAs水平,比较了不同膳食补充剂的有效性。血浆中各类脂肪酸水平可用于监测糖尿病和糖尿病肾病患者疾病的发展进程,也可用于各种风险评估,如ZHANG等[20]研究妊娠期孕妇脂肪酸水平与妊娠期糖尿病亚型的关系时,采用GC定量分析血清脂肪酸发现,妊娠早期ALA和DHA水平升高明显增加妊娠期空腹血糖升高女性发生妊娠期糖尿病的风险;汪洁云等[21]使用GC检测肥胖儿童与健康儿童多不饱和脂肪酸水平时发现,肥胖儿童血清ω-3 PUFAs水平为(6.75±2.27)%,健康儿童为(10.35±3.30)%。GC有效率高、选择性强、分析过程耗时短和标本量需求少等优点,目前为生物标本中各类脂肪酸检测和定量的首选方法。GC-MS不仅可以提供更多的结构信息,同时因为MS完善的脂肪酸数据库,该方法的有效性和选择性也更高[18]。

2.2.3LC 目前普遍采用的是高效LC(HPLC),该方法基于待分析物在高压下被固定相分离,随后被相应的溶剂洗脱后实现对物质的检测。检测器主要包括紫外/可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。SUN等[22]采用LC-MS/MS对精神分裂症患者血浆中未酯化的DHA进行检测,利培酮单药治疗患者血浆DHA水平为(6.40±2.74)μg/mL,氯氮平单药治疗患者血浆DHA水平为(6.67±2.77)μg/mL,氯氮平和利培酮联合治疗患者血浆DHA水平为(5.93±2.75)μg/mL,对照健康人群血浆DHA水平为(12.31±4.89)μg/mL。目前,LC或HPLC检测人体血液或组织中包括DHA在内的多不饱和脂肪酸通常需要对标本进行前处理,如甲基酯衍生化等,以提高检测的灵敏度,因而会导致耗时较长。此外,相对于TLC,LC成本更高,与GC相比则存在溶剂消耗量较大和选择性较低等缺点[18]。

2.3NMR NMR是一种用于结构解析或物质定量的分析技术,其原理是利用原子核的磁矩,在恒定磁场和高频电磁波共同作用下且满足一定条件时,发生共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。其中1H和31P由于高度灵敏是NMR光谱进行脂肪酸定量分析的主要自旋原子核[23],13C由于灵敏度较低,13C在NMR中的应用相对较少。如THESING等[24]采用NMR对2 724例来自荷兰抑郁和焦虑研究的受试者血浆DHA水平进行检测,结果显示,中位DHA水平为0.13 mmol/L。BARRILERO等[25]开发出一款针对1H NMR检测人体血浆脂肪酸并进行定量的生物信息学工具(LipSpin),其定量的DHA结果与质谱结果呈明显正相关(r=0.96,P=4.9×10-26)。

目前,因NMR设备昂贵且结果需要专业人士解读,采用该设备分析人体脂肪酸水平并不普遍。此外,与MS定量脂肪酸比较,NMR存在灵敏度低、信号重叠、信号分离能力差等问题,其中31P NMR只能用于含P的脂肪酸或DHA分析[23]。但NMR的优势在于重复性好、轻松辨别分子结构、仪器稳定性好、提供分子动力学信息和直接获取定量数据,同时进行分析时不会破坏标本等。

2.4NIR NIR是一种利用近红外谱区(650～1 100 nm)包含的光谱信息对有机物质水平及结构进行分析的技术,信息源主要是物质内部原子间振动的倍频与组合频。由于NIR在采样技术上独有的快速、无损、高效、低成本、采样重现性好、测量方便、操作性强等优点,被广泛用于农业、工业、医学等多个领域。

目前,NIR在医学方面的应用主要集中在对大脑功能的分析[26]、血液中各成分,如血糖、总胆固醇、甘油三酯、转移酶和尿酸等的检测及体液中的一些蛋白检测,对DHA水平分析的研究较少见。已报道的主要针对三文鱼、猪、牛、羊等动物肉或鱼油、藻油中DHA水平检测[27-28]。目前,还没有基于近红外的人体血液DHA水平检测的报道,仅有部分采用傅里叶变换红外光谱技术检测人体口腔黏膜和人乳多不饱和脂肪酸水平的研究[29]。

目前,NIR检测DHA技术有限,且因DHA水平较低,采用NIR检测误差通常相对于其他脂肪酸偏大。NIR也存在设备昂贵及结果解读要求专业人士等不足。另外,NIR获得的数据尚缺乏标准化的分析方法及无法进行绝对定量。

3 小结与展望

DHA作为人类必需的长链多不饱和脂肪酸之一,在人体无法自主合成。因此,准确检测人体DHA水平成为预防因DHA不足或缺乏引起的疾病的关键。目前,DHA尚无标准化检测方法,而已有的检测方法多种多样,这导致人体DHA水平检测结果参差不齐,无法对DHA水平与疾病状态相关性进行有效评估,更无法提出一个合理的健康人群DHA水平参考区间。为此,本研究对当前广泛使用的人体DHA水平检测方法进行综述。

3.1优化色谱技术 目前,广泛用于人体DHA水平评估和检测的方法包括膳食调查法、色谱法及近几年逐渐开始使用的NMR和NIR。其中膳食调查法虽然能够对膳食摄入脂肪酸水平与疾病之间相关性进行评价,但膳食摄入量不能替代人体内实际的脂肪酸或DHA水平。而NMR和NIR设备昂贵,无法普遍使用。因此,当前最理想的可实现DHA水平标准化检测的是色谱法,尤其是广泛使用的GC。近年来,GC的检测灵敏度、特异度或检测下限因需要偶联各种质谱仪[23],如三重四极杆质谱、时间飞行质谱或离子阱质谱等有了明显改善。当下,色谱技术仍存在标本前处理时间久和脂肪酸内标缺乏导致脂肪酸定量不精准等问题。因此,色谱法DHA检测方法仍需继续优化以期更加简洁、直接、精准。

3.2完善标本收取、保存和结果解读的科学性 人体DHA水平的准确测量还存在其他干扰因素,如生物标本的保存方式。目前最常用于检测DHA的生物标本为血浆和红细胞。将红细胞冻存于-20 ℃条件下数日,DHA水平明显下降;当置于室温或零度以上的冰箱,红细胞中DHA水平则较为稳定;将标本冻存在-80 ℃条件下,红细胞中的DHA水平可以稳定保持数年[30]。此外,尽管血浆或红细胞中的DHA水平被广泛用于人体DHA水平评估,然而因人群年龄、疾病状态等差异,通过膳食摄入的DHA或使用DHA制剂补充的DHA与人体DHA水平的变化并非始终有相关性[31]。因此,根据实验目的选择合适的生物标本、注意标本保存方式并基于人群特点对检测结果进行科学评估和分析,对准确获取人体DHA水平并进行合理补充至关重要。

3.3提出健康人群DHA水平参考区间 目前国内外均少见推荐人体DHA水平正常参考区间的报道。今后有望在比较现有检测方法优缺点的基础上,国内各大医院检验科能共同制订1项DHA检测标准化指南,就检测标本类别、标本检测相关设备及检测结果的科学解读等达成共识,并将该指南广泛推广应用,将为未来预防和治疗DHA缺乏提供重要指导。