液相色谱-串联质谱法分析花生油中的黄曲霉毒素

黄小小 莫秋云

摘 要：目的：建立一种样品前处理简易、快速、成本低的液相色谱-串联质谱法，对花生油样品中黄曲霉毒素进行定量分析。方法：花生油样品经甲醇-水（7∶3）提取，以10 mmol·L-1乙酸铵溶液-甲醇作为流动相进行梯度淋洗，采用电喷雾正离子模式多反应监测扫描，外标法定量。利用所建立的分析方法对样品进行高、中、低3水平的加标实验，并对实际样品中黄曲霉毒素含量进行测定。结果：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.2～10.0 ng·mL-1呈现良好的线性相关性，相关系数分别为0.999 6、0999 5、0.998 8、0.999 7；加标回收率在72.5%～102.4%；检出限分别为0.02 μg·kg-1、0.02 μg·kg-1、0.01 μg·kg-1、0.03 μg·kg-1；相对标准偏差均＜9.2%，符合国标要求。利用该方法对实际样品中黄曲霉毒素含量进行测定，所得结果与GB 5009.22—2016中的第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法相近。结论：该方法在确保准确度的前提下，具有较好的选择性和高灵敏度，准确高效，可用于花生油中黄曲霉毒素的检测。

关键词：花生油；黄曲霉毒素；液相色谱-串联质谱法

Abstract： Objective： To establish a simple， rapid and low-cost liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for quantitative analysis of aflatoxins in peanut oil samples. Method： Peanut oil samples were extracted by methanol-water （7∶3）， and gradient elution was carried out with 10 mmol·L-1 ammonium acetate solution-methanol as mobile phase. Electrospray positive ion mode multiple reaction monitoring scanning was used， and external standard method was used for quantitative analysis. The established analytical method was used to carry out high， medium and low three levels of standard addition experiments on samples， and the content of aflatoxin in actual samples was determined. Result： Aflatoxin B1， B2， G1， G2 showed good linear correlation in the range of 0.2～10.0 ng·mL-1， the correlation coefficients were 0.999 6， 0.999 5， 0.998 8， 0.999 7 respectively. The recovery was 72.5%～102.4%. The detection limits were 0.02 μg·kg-1， 0.02 μg·kg-1， 0.01 μg·kg-1， 0.03 μg·kg-1， respectively. The relative standard deviation was less than 9.2%， which met the requirements of national standard. The method was used to determine the content of aflatoxin in actual samples， and the results were similar to those of the first method of GB 5009.22—2016 isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Conclusion： This method has good selectivity， high sensitivity， accuracy and high efficiency under the premise of ensuring accuracy， and can be used for the detection of aflatoxin in peanut oil.

Keywords： peanut oil; aflatoxins; liquid chromatography-tandem mass spectrometry

黃曲霉毒素是由黄曲霉及寄生曲霉等真菌毒素代谢产生的有毒性物质[1-2]。黄曲霉毒素及其代谢产生的衍生物有20多种，其主要由一个呋喃环和一个香豆素组成。自然界中存在最多的黄曲霉毒素是G1、G2、B1、B2、M1与M2，其中黄曲霉毒素B1毒性最强，是剧毒物质氰化钾的10倍，砒霜的68倍，被世界卫生组织癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物[3]。日常生活中，花生及其制品极易被黄曲霉毒素侵染，含量可达到23～500 μg·kg-1[4]，《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）要求花生及其制品中黄曲霉毒素含量不得超过20 μg·kg-1。小作坊榨取的花生油中黄曲霉毒素污染程度普遍偏高，不符合国标要求。因此，需要探究更多有效、快速、便捷、准确的检测方法，保证花生及其制品的食用安全性，保障消费者的身体健康。目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱-柱后衍生法、高效液相色谱-柱前衍生法、酶联免疫吸附筛查法和液相色谱-串联质谱法等。其中，前4种检测方法试剂消耗量大，成本高，操作复杂，对实验人员的身体健康危害大，灵敏度低，耗时长，对环境污染严重，不适宜大批量检测。液相色谱-串联质谱法具有操作简便、成本低、对环境和试验人员友好、效率高等优点，通过加标回收试验和实际样品检测验证发现，该方法能实现对黄曲霉毒素的定性定量检测，满足相关国家标准的要求。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2混合标准品，浓度为1 ?g·mL-1，坛墨质检科技股份有限公司；甲醇（HPLC），美国Fisher公司；乙酸铵（GR）；尼龙66针式微孔滤膜，直径0.22 ?m。

1.2 仪器设备

LCMS-8030高效液相三重四级杆质谱仪，岛津公司；Multi Reax型涡旋振荡器，海道夫（中国上海）；AE-200型1/10 000电子天平，上海合资；Milli-Q Direct16型超纯水装置，电阻率：18.2 MΩ·cm，Millipore。

1.3 方法

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS（150 mm×2.0 mm，ID）；流动相：A相为10 mmol乙酸铵溶液，B相为甲醇；梯度洗脱：2%→90%B（0.5～5 min），90%B（5～8 min），90%→2%B（8～10 min）；流速：0.30 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾正离子源模式；仪器检测电压：4.50 kV；DL温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；干燥气流速：15.00 L·min-1；检测方式：多离子反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。4种黄曲霉毒素待测物的定性和定量MRM扫描参数见表1。

1.3.3 样品处理

称取5 g（精确至0.000 1 g）花生油于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇水溶液（体积比为7∶3），涡旋混匀后于涡旋振荡器中振荡20 min，在4 ℃条件下10 000 r·min-1离心10 min，准确吸取澄清液1 mL于2 mL离心管中，使用超纯水定容至刻度，混匀，以10 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm滤膜，待上机测试。

1.3.4 标准曲线绘制

黄曲霉毒素混合标准使用液（100 ng·mL-1）：准确移取一定量黄曲霉毒素混合标准储备液（1.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，混匀，密封后-20 ℃下避光，有效期3个月。黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取一定量黄曲霉毒素混合标准使用液（100 ng·mL-1）于10 mL容量瓶中，使用空白基质溶液逐级稀释至刻度，混匀，得到浓度分别为0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的黄曲霉毒素混合标准工作液，过0.22 μm滤膜后，待上机。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和线性范围

以峰面积为纵坐标，黄曲霉毒素浓度为横坐标，绘制线性回归曲线，并计算回归曲线方程及相关系数，根据仪器测出的信噪比，计算检出限和定量限。回归曲线方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2可知，4种黄曲霉毒素的线性关系良好，检出限和定量限均满足相关国家标准的要求。图1为4种黄曲霉毒素对照品（16.0 μg·kg-1）的总离子流色谱图。

2.2 加标回收试验

在花生油阴性样品中分别添加3种浓度（1.6 μg·kg-1、16.0 μg·kg-1、64.0 μg·kg-1）的黄曲霉毒素混合标准溶液，参照1.3所建立的仪器方法条件進行测定，每份样品重复测定6次，计算加标回收率和精密度（表3）。由表3可知，4种黄曲霉毒素的加标回收率在72.5%～102.4%，相对标准偏差在5.6%～9.2%，说明该方法准确度和精密度均满足要求。

2.3 市售样品测定

采用本文建立的分析检测方法对市售30种散装花生油进行测定，所得结果见表4。同时运用《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）第一法“同位素稀释液相色谱质谱法”，通过免疫亲和柱净化，采用内标法对30种散装花生油样品进行了测定。实验结果表明，两种方法所得检测结果相近，同时验证了本法的可靠性[4-7]。《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中规定花生油中黄曲霉毒素不得超过20 μg·kg-1。由表4可知，30种散装花生油中黄曲霉毒素检出率为96.7%，超标率为23.3%，合格率仅为76.7%。由此看出，目前市售散装花生油受黄曲霉毒素污染情况比较严峻，其中黄曲霉毒素B1污染最为突出。这可能是因为散装花生油在收购、储存、加工以及销售等环节卫生情况不达标，导致散装花生油中黄曲霉毒素污染严重。

3 结论

本研究运用液相色谱-串联质谱法，建立了同时检测花生油中4种黄曲霉毒素的方法。实验结果表明，本方法能够实现对花生油中4种黄曲霉毒素进行准确快速的定性定量分析，具有快速、简便、成本低等优势，满足相关国家标准方法检出限和定量限的要求。

参考文献

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[3]董靖，张潇，刘越，等.2种高效液相色谱仪测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2020，11（7）：2190-2196.

[4]杨忠红.浅析花生油中黄曲霉毒素的检测及去除方法[J].粮食流通技术，2007（4）：39-41.

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[6]苏娜，贾卫华.食品检验检测的质量控制及细节问题[J].中国食品，2021（9）：42.

[7]王芳，陈潘，席斌，等.离子迁移谱技术在食品检测中的应用研究进展[J].食品研究与开发，2021，42（8）：179-185.

作者简介：黄小小（1987—），女，瑶族，广西贺州人，硕士，主管技师。研究方向：理化检验。

通信作者：莫秋云（1989—），女，广西贺州人，硕士，工程师。研究方向：食品安全检验检测。E-mail：27411896767@qq.com。