自体富血小板血浆联合自体骨移植术治疗兔桡骨骨不连实验研究

陈植 徐芳露 陈兵乾

[摘   要]   目的：觀察自体富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）联合自体骨移植术治疗兔桡骨骨不连的效果。方法：成年新西兰兔96只，随机分为PRP-植骨组、单纯植骨组和对照组各32只。将所有实验兔左前臂桡骨中段截除1 cm骨段，骨蜡封闭断端髓腔，制成骨不连动物模型。PRP-植骨组采用自体髂骨植入骨折端+骨折端注射自体PRP治疗，单纯植骨组仅在骨折端植入自体髂骨，对照组不作处理。术后2、4、8、12周时采用大体形态观察、X线摄片、Micro-CT检查、组织学观察及生物力学检测等手段对骨不连愈合情况进行评估。结果：大体观察、X线摄片、Micro-CT、组织学及生物力学检测结果显示，与单纯植骨组比较，PRP-植骨组术后2、4周时软骨细胞增生明显增多，术后8周时已有明显骨痂形成。PRP-植骨组术后2、4、8、12周被破坏时的最大载荷（payload-maximum，Pm）及破坏弯矩（moment，M）均高于同期单纯植骨组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：自体富血小板血浆联合骨移植术治疗兔桡骨骨不连效果良好，骨愈合速度更快，骨愈合强度更高。

[关键词]   实验兔；骨不连；富血小板血浆；骨移植术；生物力学

[中图分类号]   R683.41 [文献标志码]   A [DOI]   10.19767/j.cnki.32-1412.2024.01.002

Experimental study of autologous platelet-rich plasma combined with autologous bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion

CHEN Zhi1， XU Fanglu2， CHEN Bingqian1

（1Department of Orthopedics， Changshu No.1 People′s Hospital， Jiangsu 215500;

2Department of Nephrology， Changshu No.2 People′s Hospital）

[Abstract]   Objective：To observe the effect of autologous platelet-rich plasma （PRP） combined with autologous bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion. Methods：Ninety-six adult New Zealand rabbits were randomly divided into three groups with 32 rabbits in each group， which were named as PRP-bone grafting group， the simple bone grafting group and the control group. A 1 cm bone segment was excised from the middle radium of the left forearm of all the rabbits in the three groups. The medullary cavity of the broken end was closed with bone wax. The rabbits in PRP-bone grafting group were treated with autologous iliac bone grafting and injection of autologous PRP at the fracture end， the rabbits in the simple bone grafting group were treated with autologous iliac bone grafting at the fracture end and the rabbits in the control group were not treated. At 2， 4， 8 and 12 weeks after operation， gross morphological observation， X-ray， Micro-CT， histological analysis， and biomechanical test were used to evaluate the healing of bone nonunion. Results：The results of gross observation， X-ray film， Micro-CT， histology and mechanical examination showed that the proliferation of chondrocytes in PRP-bone grafting group was significantly higher than that in the simple bone grafting group at 2 and 4 weeks after operation， and callus formation was obvious at 8 weeks after operation. The payload-maximum （Pm） and failure moment （M） in PRP-bone grafting group were higher than those in the simple bone grafting group at 2， 4， 8 and 12 weeks after operation（P<0.05）. Conclusion： The effect of autologous PRP combined with bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion is good， and the bone heals faster and stronger.

[Key words]   experimental rabbits; nonunion of bone;platelet-rich plasma; bone grafting; biomechanics

骨不连又称骨折不愈合，是骨折后常见的并发症，5%以上骨折患者术后出现骨不连[1]。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）治疗是近年来兴起的新型组织修复技术，PRP中富含大量生长因子，可促进人体各种组织的再生，目前广泛用于慢性肌肉骨骼损伤、创面及软组织修复、关节疼痛、运动医学等领域。血小板可释放多种生长因子，激活间充质细胞，触发血管生成，促进成骨细胞和软骨细胞的增殖和趋化，在骨缺损治疗中具有促进骨愈合作用[2-3]。本研究构建兔桡骨骨不连动物模型，评估PRP联合自体骨移植术治疗骨不连的效果。

1   材料与方法

1.1   实验动物   清洁级成年新西兰雄性大白兔96只［苏州湖桥生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2020-0002］，兔龄6～7月，体质量2.5～3.0 kg，按数字随机法分为PRP-植骨组、单纯植骨组和对照组各32只。单笼饲养，室温20 ℃、湿度65%，饮水量每日100 mL/kg，饲料主要为高质量植物蛋白和优质脱水苜宿草（江苏美迪森生物医药有限公司），每日50 g/kg，每日分2次投喂。投喂7日后，在苏州药明康德新药开发有限公司［实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2018-0046］进行实验，在无菌条件下制备兔桡骨骨不连模型。

1.2   实验方法

1.2.1   制备骨不连动物模型：采用10%水合氯醛经兔耳缘静脉麻醉，剂量2 mL/kg，兔左前臂备皮，安尔碘消毒术区，铺无菌巾单。取左前臂中段纵行切口，依次切开皮肤、皮下组织，暴露左桡骨中段，用小型骨刀截除1 cm骨段，骨蜡封闭断端髓腔，缝合切口。实验兔苏醒后按前述饲养方式继续饲养，切口定期消毒，每日肌肉注射青霉素200 000 U，连续1周。术后12周对所有实验兔左前臂摄X线片，确认骨不连模型制备成功。

1.2.2   自体PRP制备：采用Landesberg法，从实验兔耳缘静脉抽取静脉血10 mL，注入含抗凝剂试管内，200 g离心10 min，得到3层液体，顶层为血小板血浆层，中间层为血小板濃缩物层，底层为红细胞层。吸取全部顶层及交界面下3 mm液体，注入另1支不含抗凝剂试管中，200 g离心10 min，再次得到分为3层的液体，吸除3/4上清液，将剩余液体打匀，即得到约0.8 mL PRP。

1.2.3   手术方法：PRP-植骨组：实验兔麻醉后，常规备皮、消毒铺巾。在兔髂骨处作一小切口，凿取少量松质骨备用。于左前臂沿原切口切开皮肤，暴露桡骨骨不连处，去除断端硬化组织，打通髓腔。将自体松质骨植于骨不连处，并将自体PRP填充于植骨处，逐层缝合切口。单纯植骨组：手术步骤同PRP-植骨组，仅将自体松质骨植于骨不连处。对照组：不作处理。麻醉苏醒后按照前述饲养方式继续饲养，切口定期消毒，每日肌肉注射青霉素200 000 U，连续1周。

1.3   观察指标   在术后2周、4周、8周、12周时每组分别处死8只实验兔，切取左侧桡骨完整骨段，作以下指标观察。（1）大体形态观察。（2）X线摄片检查：观察骨不连修复情况。（3）Micro-CT检查：观察骨不连修复情况。（4）组织学观察：桡骨骨段经脱钙、脱水、固定、透明后，用石蜡包埋，切片后行HE染色，在光学显微镜下观察新骨生成情况。（5）生物力学检测：采用拉扭双轴动静态万能材料力学试验机对骨段进行4点弯曲测试，测定被破坏时的最大载荷（payload-maximum，Pm）和破坏弯矩（moment，M）。

1.4   统计学处理   应用SPSS 24.0统计学软件进行数据处理分析。计量资料以■±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2   结      果

2.1   大体形态观察   术后2周：PRP-植骨组、单纯植骨组植入骨与自体骨交界面出现肉芽组织桥接。术后4周：PRP-植骨组、单纯植骨组缺损位置可见淡红色硬纤维，植入骨和自体骨之间可见模糊接线，连接不牢固，植入骨表面出现纤维骨痂，PRP-植骨组植入骨表面纤维骨痂多于单纯植骨组。术后8周：PRP-植骨组骨痂呈膨胀性生长，植入骨表面腔隙充填，植入骨和自体骨结合牢固。单纯植骨组骨痂连续，植入骨和自体骨界限模糊，结合不够牢固，刀片可分离。术后12周：PPR-植骨组缺损处骨组织覆盖完全，愈合良好，呈现骨性愈合。单纯植骨组植入骨表面出现连续坚硬的骨痂，植入骨和自体骨结合较为牢固。对照组骨缺损位置出现疤痕纤维结缔组织充填，截骨端骨折硬化。

2.2   X线摄片检查   术后2周：PPR-植骨组出现少量类骨痂样物质，单纯植骨组与对照组中骨缺损间隙明显。见图1。术后4周：PPR-植骨组正常骨质与植骨处间隙变小，间隙内可见骨痂。单纯植骨组中间隙仍明显可见。对照组间隙清晰。见图2。术后8周：PPR-植骨组中正常骨质与植骨处附着紧密，间隙位置出现新生类骨组织。单纯植骨组正常骨质与植骨处出现细小间隙，骨痂充填间隙。见图3。术后12周：PPR-植骨组缺损位置成熟板层状骨组织充填，可见正常骨质，骨缺损位置基本修复。单纯植骨组中正常骨质与植骨处附着紧密，新生类骨组织充填间隙。对照组仅少量骨痂形成，骨折断端清晰可见，边缘硬化。见图4。

2.3   Micro-CT检查   术后2周：PRP-植骨组和单纯植骨组植入骨与自体骨交接位置清晰，断端整齐，断端及缺损处骨密度均较对照组高。术后4周：PRP-植骨组缺损位置形成骨痂，植入骨出现少量吸收。单纯植骨组缺损位置出现少量骨痂。术后8周：PRP-植骨组缺损位置骨痂大量形成，覆盖植入骨，两断端被骨痂桥接，植入骨密度增加，缺损位置分区模糊，植入骨吸收明显，骨髓腔部分出现再通。单纯植骨组缺损位置骨痂形成增多，覆盖大部分植入骨，两端间隙略微模糊，植入骨两端密度增加，部分植入骨吸收。术后12周：PRP-植骨组缺损处皮质骨新生改造基本完成，新生骨密度接近正常骨，植入骨基本吸收，植入骨与自体骨连接自然，骨髓腔基本再通。单纯植骨组缺损处骨痂大量形成，覆盖植入骨，植入骨大部分吸收，皮质骨基本连续，骨髓腔部分再通。对照组未形成连续型骨痂，缺损处呈现骨折硬化，骨折清晰，呈萎缩型骨不连表现。

2.4   组织学观察   术后2周：PRP-植骨组植入骨孔隙出现少量软骨细胞和成骨细胞，单纯植骨组变化不明显。术后4周：PRP-植骨组植入骨孔隙出现大量软骨细胞和成骨细胞，并在植入骨边缘见软骨细胞和成骨细胞，新生骨痂呈条索状，覆盖在植入骨，缺损两端成骨细胞更多，形成原始骨髓腔，载体骨内发现毛细血管新生。单纯植骨组植入骨孔隙出现少量软骨细胞和成骨细胞。术后8周：PRP-植骨组植入骨孔隙新生骨组织增加，可见破骨细胞，新生骨取代部分植入骨，见骨髓组织，新生骨痂（外周）成片状，植入骨表面骨痂覆盖面积大。单纯植骨组植入骨孔隙出现大量软骨细胞和成骨细胞，在植入骨边缘也可见成骨细胞等。术后12周：PPR-植骨组植入骨成熟骨组织量大，植入骨大部分被吸收，骨髓组织增加，新骨、自体骨间可见骨小梁成熟。单纯植骨组植入骨孔隙新生骨组织增加，破骨细胞可见，出现新生骨，新生骨痂（外周）成片状，覆盖面积扩大。对照组缺损位置被大量纤维结缔组织填充，骨断端髓腔封闭，未见新骨生成。

2.5   生物力学检测   术后2、4、8、12周Pm及M，PRP-植骨组＞单纯植骨组＞对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3   讨      论

长骨骨折术后骨不连发生率非常高，5%～10%[4]。自上世纪60年代AO组织提出解剖复位、坚强内固定及早期功能锻炼的骨折治疗原则以来，许多复杂骨折收到良好的治疗效果，但时有骨不连的发生。骨折复位固定不牢靠、术后活动和负重不当可造成骨不连。骨不连的病理改变包括骨端的吸收硬化、骨质疏松、骨与软组织萎缩，并伴有关节僵硬。临床上可以通过X线片、CT检查等观察骨缺损病灶具体情况，骨不连表现为骨折端互相分离，骨端硬化，间隙较大，萎缩疏松，髓腔封闭等征象。骨不连不仅延长患者患病时间、延迟功能恢复，同时也会对患者心理产生不良影响。因此，一旦确诊骨不连，应立即采取相应方法治疗。

手术治疗是目前公认的治疗骨不连最有效方法，包括内固定、外固定、骨移植以及各种方法的联合应用。自体松质骨移植术是治疗骨不连的“金标准”，但单纯采用植骨治疗术后恢复时间长，因此有学者提出可将骨移植术与PRP技术联合运用。自体PRP含有丰富的生长因子和高浓度血小板[5]，血小板活化后释放转化生长因子β、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子以及表皮生长因子等多种生长因子，促进软骨组织和骨组织修复，加速骨不连患者骨组织修复。PRP制备方法较多，根据全血中各组分沉降系数不同，不同离心次数、离心力和离心时间所制备的PRP中血小板体积分数以及各种生长因子的量和活性各不相同。目前国际上尚无统一的标准化PRP提取方法。在诸多制备方法中Landesberg法具有血小板體积分数高、活化率低的优点，故本研究采用Landesberg法。本研究大体观察、X线摄片及Micro-CT检查发现，PRP-植骨组术后各时期骨痂形成速度、形成量均优于单纯植骨组，骨不连愈合速度明显较单纯植骨组更快，术后2、4、8、12周被破坏时的最大载荷及破坏弯矩均高于同时间单纯植骨组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。分析原因：PRP血小板经活化后释放的各种生长因子可以加速基质干细胞分化，促进成骨细胞和成纤维细胞的增殖，加快纤维蛋白与细胞外基质的合成[6-7]。PRP中含有高浓度白细胞，在控制感染方面具有积极意义。由于PRP源于自体，无免疫排斥，治疗安全性较高。

综上所述，在兔桡骨骨不连的治疗中，在常规植骨基础上配合自体PRP治疗，可达到加速骨缺损修复，促进骨愈合的效果，为临床上PRP联合骨移植术治疗四肢长骨骨不连提供一定的证据支持。

[参考文献]

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[2] 梁庆优，邓春林. 长骨大段骨缺损修复材料的力学性能及制备策略［J］. 材料导报，2021，35（13）：13100-13108，13118.

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[7] 吴情，王慧慧，华洪飞，等. 自体骨联合富血小板纤维蛋白用于埋伏阻生第三磨牙拔除后下颌第二磨牙远中骨缺损修复的随机对照研究［J］. 口腔颌面外科杂志，2022，32（2）：100-105.

[收稿日期] 2023-08-04

（本文编辑   王晓蕴）