肥胖模型小鼠肝脏的病理变化及代谢组分析

丁宝锋，王小爽，王 芳，余 佳

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 重大疾病共性机制研究全国重点实验室，北京 100005

肥胖(obesity)以脂质积累过多和低度慢性炎性反应为主要特征,与当今人类的许多健康问题密切相关,如心脑血管疾病、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝[1-2]等。目前,由于饮食结构的改变,全球已出现近20亿肥胖和超重的个体[3],因此肥胖的高发病率已经成为威胁公共健康的一个重要因素。肥胖发生的主要原因是能量的产生和消耗之间的不平衡,由于肥胖与多种疾病的发生高度相关,因此全方面了解肥胖对人体造成的影响是非常重要的[4]。肥胖小鼠模型的建立,对于研究者探究肥胖的发生机制以及寻找潜在的治疗靶点具有非常重要的作用。

肝脏是人体中最重要的代谢器官,是多种物质代谢的主要场所[5]。糖类、脂类及氨基酸三大营养物质的代谢过程均由肝脏完成,其中的生化过程对于维持代谢平衡、排出代谢废物和维护生命健康等方面都具有极其重要的作用[6-7]。同时,肥胖会引起肝脏的功能异常,可能进一步诱发非酒精性脂肪肝,非酒精性脂肪性肝炎以及肝纤维化等多种疾病表现[8-10]。此外,肥胖一旦导致肝功能受损,机体多个重要脏器功能亦可能出现障碍。综上,基于肝脏在代谢功能方面的重要性,从代谢的角度对肝脏及其相关疾病进行系统研究就显得尤为重要。本研究通过对高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏进行病理观察以及代谢组学研究,揭示了肥胖小鼠肝脏的代谢改变,为后续对肝脏疾病的机制研究与临床治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及饲料:用于建模的C57BL/6J雄性小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)40只,饲养于中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所动物实验室;普通饲料(xt013,江苏省协同医药生物工程有限责任公司);高脂饲料(D12492,Research Diets公司)。

1.1.2 主要试剂:4%多聚甲醛(P4500,Lablead公司);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(C0105S,碧云天生物技术有限公司);天狼猩红染色试剂(S8060,北京索莱宝科技有限公司);纯甲醇(10014108,国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型的建立:6周龄的小鼠随机分成两组:一组饲喂普通饲料(chow diet,CD),作为对照组;另一组饲喂高脂饲料(high-fat diet,HFD),作为实验组。

1.2.2 肝脏组织病理学的检测:取1 cm×1 cm×0.5 cm的小鼠肝脏组织,使用10倍体积的4%多聚甲醛固定后,进行石蜡包埋,取5 mm的切片进行HE染色和天狼猩红染色,评估其病理学改变。

1.2.3 代谢组学检测及分析:1)取样:剪取一片小鼠肝脏组织于标记好的锡箔纸中,拍扁置于液氮速冻,随后放入-80 ℃冰箱保存。2)样本萃取及检测:将冻存的肝脏组织置于干冰上,用预冷的镊子取出5～20 mg组织于离心管中称重并记录。称取完成后在管中放入研磨小钢珠,然后置于震荡研磨机中研磨成粉末。根据所取的肝脏组织质量按照1∶40的比例加入80%甲醇(1 mg组织加入40 mL的80%甲醇)萃取,震荡,使肝脏组织粉末充分溶解于甲醇中(全程干冰上操作,防止组织融化)。4 ℃,15 000 rpm离心30 min,取上清液于新管。4 ℃,15 000 rpm重复离心30 min,取50 mL上清于进样瓶后通过超高效液相色谱-质谱对肝脏代谢组进行检测。3)代谢组分析:原始质谱数据采用El-MAVEN软件进行峰检测、峰对齐以及归一化。进一步数据分析采用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)分析网站进行主成分分析(principal component analysis,PCA)、t检验和差异倍数分析(fold change analysis)。本研究结合差异倍数(fold change)和Pvalue值来筛选差异代谢物。筛选条件:fold change≤0.5或者≥2;P<0.05,两者取交集得到差异代谢物。并基于生物学数据库KEGG(https://www.kegg.jp/)进行代谢通路分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 正常组和高脂组小鼠体质量变化和肝脏质量变化

分饮食饲养24周后HFD组小鼠体质量明显高于CD组,虽然在建模的不同时间点,CD组和HFD组小鼠平均体质量均有所增长,但HFD组小鼠体质量增长幅度更大。在建模第8周、第16周和第24周HFD组小鼠体质量均显著高于 CD 组(P<0.0001)(图1A)。同时,HFD 组小鼠的肝脏较CD组明显变大,泛白,表面出现明显的脂滴沉积,并且肝脏质量也显著高于CD组(图1B,C)。综上,通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠在体质量和肝脏质量上均较对照组有显著增加。

A.body weight of HFD and CD group mice at different modeling time;B.liver of HFD and CD group mice;C.liver weight of HFD and CD group mice; *P<0.0001 compared with CD group.

2.2 正常组和高脂组小鼠肝脏病理特征观察

2.2.1 肝脏的HE染色结果:CD组肝脏结构完整,肝小叶轮廓清楚完整,肝细胞索排列整齐,肝窦清晰可见。未见炎性细胞浸润和纤维组织增生。肝细胞呈圆形,细胞核位于肝细胞中央,肝脏间质未见炎性反应(图2A)。

A.HE staining of hepatocytes in CD group mice (×10); B-D.HE staining of hepatocytes in HFD group mice (×40;×100;×400);Arrows indicate steatosis of liver;E.Sirius red staining of hepatocytes in CD group mice (×10);F-H.Sirius red staining of hepatocytes in HFD group mice (×40;×100;×400); Arrows indicate fibrosis of liver.

HFD组肝脏肝小叶结构紊乱,未形成典型肝窦肝索结构,中央静脉周围和间质见轻微单核性炎性细胞浸润。肝细胞严重变性,细胞大小和形态不一,部分肝细胞呈空泡变性,且肝脏出现大面积脂肪变性(图2B～D)。

2.2.2 肝脏天狼猩红染色结果:CD组小鼠肝脏天狼猩红染色呈阴性,肝细胞及间质内未见天狼猩红阳性反应,肝细胞间和小叶间均未见纤维细胞增生,仅在血管壁(含胶原纤维)可见红色染色的阳性细胞(图2E～H)。

2.3 正常组和高脂组小鼠肝脏的代谢组学分析

为了进一步探究肥胖是否伴随着肝脏代谢能力的改变,本研究对HFD和CD组小鼠的肝脏进行了非靶向代谢组学测序。首先,主成分分析(PCA)结果显示HFD与CD组之间具有明显的分离趋势,提示两组的肝脏代谢谱有显著的差异(图3A);同时,对HFD和CD组肝脏之间的差异代谢物进一步进行筛选(fold change≤0.5或≥2且P<0.05),共发现151个差异代谢物,其中HFD较CD组上调了40个代谢物,下调了111个代谢物(图3B);最后,通过对两组的差异代谢物进行KEGG通路富集,结果显示HFD较CD组小鼠的肝脏差异代谢物主要集中在苯丙氨酸代谢、TCA循环、鞘脂类代谢、精氨酸生物合成和初级胆汁酸的生物合成等代谢通路中(图3C)。

A.PCA analysis showed significant differences between HFD and CD group mice;B.volcanic map of HFD vs CD,up-regulated metabolites:40,down-regulated metabolites:111;C.enriched pathways of differential metabolites between HFD and CD group mice.

3 讨论

代谢组学分析技术已经成为现代生命科学研究的重要手段之一,能够帮助研究人员更加深入地了解生物体内的代谢环境和代谢网络的运行规律,进而为患者提供更为准确的临床诊断和个性化治疗方案[11]。但是目前对于肥胖小鼠肝脏代谢组学的相关研究仍然较为缺乏。因此探究肥胖小鼠肝脏的病理特征和代谢组学改变是非常有意义的。

此外,由于人类饮食结构的改变,全球肥胖人数逐年上涨。据研究报道,肥胖是导致非酒精性脂肪肝病等肝脏疾病的[1-2]的重要因素。本研究模拟人类肥胖的发生过程,利用高脂饮食成功诱导了小鼠肥胖模型,为研究者探究肥胖的发生机制以及寻找潜在的治疗靶点提供了参考。本研究结果显示 CD 组小鼠肝脏无明显脂滴沉积,也未见脂肪变性;HFD组小鼠肝脏在建模 24 周时出现大面积脂肪变性和轻微纤维化。通过将HFD和CD组小鼠肝脏进行代谢组学检测并辅以相应的数据分析,进一步完成了两组小鼠肝脏差异代谢物的筛选以及差异代谢通路的富集,发现与CD组相比,HFD组小鼠肝脏内代谢物组成出现巨大改变,多种代谢物出现上调或下调的变化。其中发生显著改变的肝脏代谢物富集于苯丙氨酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、鞘脂类代谢、精氨酸生物合成和初级胆汁酸的生物合成等代谢通路。

虽然苯丙氨酸代谢、 柠檬酸循环以及鞘脂类代谢等在肝病中发生紊乱的证据已经十分充足,但在目前的研究中尚不能确定这种代谢紊乱是由肝脏病变引起,还是仅仅与肥胖、胰岛素抵抗有关,这也是目前迫切需要解决的问题。不过研究者依然能够通过调节这些代谢通路的稳态来达到预防或治疗肝脏病变的目的。已有报道指出肥胖人群的肠道菌群会发生紊乱,改善肥胖人群的肠道菌群能够调节胆汁酸的合成与苯丙氨酸代谢,进而有助于肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢性疾病的治疗[12-13]。也有报道发现Omega-3 多不饱和脂肪酸可以通过维持柠檬酸循环的稳态来预防肥胖,进而保护肝脏[14]。所以,本研究发现的一系列肥胖状态下肝脏代谢通路的异常,有望对临床治疗肥胖以及相关肝病提供新的思路。

总之,本研究通过一系列相关分析,为研究肝脏病变的调控因素,挖掘肝脏的代谢调控网络,完善肝脏的代谢图谱提供了参考,对正确认识人类肝脏发育及肝脏相关疾病的病变过程以及寻找肝脏疾病的治疗靶点具有十分重要的意义。