基于网络药理学和分子对接探讨白及治疗溃疡性结肠炎的作用机制

潘 峰

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是位于直肠至结肠黏膜及黏膜下层的慢性非特异性炎症性疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻和黏液脓血便反复发作[1]。常见病因包括肠道通透性改变、肠道菌群失调、黏膜免疫应答、心理因素以及肠神经结构和功能异常[2]。目前，临床尚无根治性治疗手段，治疗难度大，并且需要长期维持治疗，有进展为结肠癌的潜在风险，严重影响患者的生活质量[3]。根据UC 的临床表现，中医将其归属于“泄泻”“痢疾”范畴[4]。脾虚、湿热内蕴是UC 活动期的的核心病机，治疗以清热解毒、健脾化湿、敛疮生肌为大法[5]。白及苦、甘、涩，微寒，归肺、肝、胃经，具有收敛止血、消肿生肌的作用，可用于治疗疮疡肿毒、溃疡病出血。药理学研究[6]发现，白及及其有效成分具有抗菌、抗肿瘤、止血、抗溃疡、促进伤口愈合等作用。国医大师朱良春提出辨证加用白及或单用白及粉可广泛用于治疗UC、肠溃疡等病。本研究通过网络药理学以及分子对接技术对白及治疗UC 的潜在作用机制进行探究。

1 材料与方法

1.1 白及活性成分及作用靶点的筛选 将“白及”作为关键词在TCMSP 数据库（http://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）平台中进行检索，并设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，筛选出白及的有效活性成分，利用Pubchem 数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取有效成分的SDF 文件，将筛选出的有效成分利用SwissTarget Prediction 数据库（http://swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测，设置概率（probability）＞0.1，最后利用Uniport 数据库（http://www.uniprot.prg）将所得到的靶点名称进行标准化。

1.2 UC 靶点的获取 将“Ulcerative Colitis”作为关键词，在Genecards、OMIM 和Disgenet 数据库中进行检索，并将得到的靶点去重后进行汇总。利用R 语言软件绘制白及有效活性成分作用靶点和UC 疾病相关靶点的韦恩图。

1.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建 利用Uniport 网站将白及的有效药物成分及对应的靶点转换为Gene Symbol，将其导入Cytoscape 3.9.1 软件绘制“药物-活性成分-靶点”网络图，利用软件中的Network Analyzer 插件进行拓扑分析，根据度（degree）值高低将各个节点进行排序，筛选出关键成分。

1.3.1 靶点蛋白互作（PPI）网络图构建 将白及和UC 交集的靶基因导入String 数据库，将物种限定为“人类（homo sapiens）”，最低交互置信度设置为“高置信度（high confidence）0.9，获取相关数据并导出，再进一步导入Cytoscape 软件中进行可视化，应用Cytoscape 软件中Cytohubber 插件的degree 功能筛选出排名前15 的Hub 基因。

1.3.2 基因本体（gene onto-logy，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用Metscape 对交集靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，导出分析数据结果，再利用R4.2.0 软件中对应的包对富集分析进行可视化处理。

1.3.3 分子对接 根据绘制的“药物-活性成分-靶点”网络及PPI 网络图筛选出degree 值排名前10的核心靶点和排名前5 的关键成分进行分子对接。通过PDB 数据库下载关键靶点蛋白的3D 结构，利用Pymol 软件和AutoDockTools1.5.7 软件对蛋白和有效成分的3D 结构进行去水、去除原有配体、加氢以及计算结合能等处理，最后将处理后的结果进行可视化。

2 结 果

2.1 白及活性成分及作用靶点筛选结果 设定OB≥30%，DL≥0.18，白及活性成分共9 个，见表1。将有效成分导入Swiss Target Prediction 数据库中检索其作用靶点，得到Probability＞0.1 的靶点蛋白277 个。

表1 白及高活性的9 种化合物

2.2 UC 靶点筛选结果 通过检索Genecards、OMIM和Disgenet 三个数据库，并将所获取的靶点去重后得到UC 相对应的靶点蛋白共1159 个。利用R 语言软件绘制药物和疾病相关靶点交集图，得到交集基因68 个，见图1。

图1 白及有效活性成分和溃疡性结肠炎相关靶点的韦恩图

2.3 “药物-活性成分-靶点”可视化结果“药物-活性成分-靶点”网络，见图2。经计算后得到degree值排名前5 的活性成分分别是1-4 叔丁基苄基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-对羟基苄基-4-甲氧基-9，10-二氢菲、4，7-二羟基-1-对羟基苄基-2-甲氧基-9，10-二氢菲、菲螺醇。

图2 白及治疗溃疡性结肠炎潜在活性成分及作用靶点网络图

2.4 PPI 网络构建结果 通过PPI 网络筛选出白及治疗UC 排名前15 的Hub 基因，如图3 所示，颜色越深代表degree 值越大，degree 值排名前10 的基因分 别 为：CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC、PTGS2、MCL1、IGF1R。

图3 白及治疗溃疡性结肠炎的Hub 基因筛选图

2.5 GO 和KEGG 分析结果 对PPI 网络核心靶点进行GO 功能富集分析后，结果获得生物过程（biological process，BP）297 条、细胞组分（cellular component，CC）58 条、分子功能（molecular function，MF）62 条。将各自结果根据P 值由小到大排序后选取前10 条进行可视化分析，如图4 所示。由图可知，BP 主要涉及信号传导（signal translation）、肽基-酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）、蛋白磷酸化（protein phosphorylation）等过程。CC 可能主要与质膜（plasma membrane）、胞浆（cytosol）、细胞质（cytoplasm）有关。MF 可能主要涉及蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、蛋白质结合（protein binding）、ATP结合（ATP binding）等功能。KEGG 通路富集分析结果共获得143 条相关作用通路，按照P 值从小到大选取前20 条通路进行可视化分析，结果显示白及治疗UC 的靶点基因主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、癌症中的蛋白聚糖、前列腺肿瘤、Rap1、MAPK 等信号通路，见图5。

图4 白及治疗溃疡性结肠炎的GO 功能富集分析

图5 白及治疗溃疡性结肠炎的KEGG 通路富集分析

2.6 分子对接结果 为进一步明确白及治疗UC 潜在活性成分与关键靶点蛋白之间的分子结合能力，基于网络药理学的分析结果，选取degree 值排名前5 的活性成分1-4 叔丁基苄基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-对羟基苄基-4-甲氧基-9，10-二氢菲、4，7-二羟基-1-对羟基苄基-2-甲氧基-9，10-二氢菲、菲螺醇与degree 值排名前10 的核心靶点CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC、PTGS2、MCL1、IGF1R 进行分子对接，对接结果详见表2。自由结合能越小说明分子与蛋白之间对接越好，结合能＜-5 kcal/mol 说明有效成分和靶点之间结合活性强。白及活性成分与UC 核心靶点蛋白的结合能基本＜-5 kcal/mol，其中有20 个结合能＜-7 kcal/mol，由此可见白及的潜在有效成分与UC 的关键靶点之间关联性很强，这些成分与靶点很有可能是白及治疗UC 的物质基础与关键作用靶点。使用PyMOL 软件对白及治疗UC 中结合能最强的活性成分和靶点的对接结果进行可视化（MOL005773-HRAS、MOL0057 73-SRC、MOL005768-SRC、MOL005756-SRC），见图6。菲螺醇与HRAS 的ASP-119、LYS-117、SER-145、LYS-147、ALA-146 残基各形成1 个氢键，与SER-17 残基形成2 个氢键，氢键的长度分别为1.8、2.2、1.9、2.2、2.4、1.9、2.3 nm。菲螺醇与SRC 的ARG-293、ARG-296、ASP-224、ARG-296 残基各形成1 个氢键，与ARG-217 残基形成2 个氢键，氢键长度分别为2.1、2.5、1.9、2.8、2.0、2.5 nm。4，7-二羟基-1-对羟基苄基-2-甲氧基-9，10-二氢菲与SRC 的ASN-292残基形成2 个氢键，与HIS-163、CLN-192 残基形成各3 个氢键，氢键的长度分别为2.8、1.9、2.1、1.9、1.8、1.6、1.9、2.8 nm。2，3，4，7-四甲基菲与SRC 的HIS-163 形成3 个氢键，与ARG-296 残基形成4 个氢键，氢键的长度分别为1.9、2.1、2.1、1.9、2.2、2.8、2.3 nm。

图6 白及主要活性成分与关键靶点分子对接图

表2 白及活性成分与关键靶点的结合能（kcal/mol）

3 讨 论

随着生活水平的提高，UC 近年发病率不断攀升，UC 长期迁延难愈，导致患者消化能力逐步下降、肠道吸收功能不良，进而出现营养不良、免疫功能失调等并发症，临床治疗颇为棘手[7]。治疗UC 的关键是抑制肠道炎症活动，目前临床上包括免疫抑制剂、抗肿瘤坏死因子-α、单克隆抗体在内的治疗手段大多都存在价格昂贵、疗程长、副作用多以及复发率高等问题[8]。中医药在治疗UC 方面具有丰富的临床经验，并且不良反应少、患者可接受度高[9-10]。谢晶日教授在治疗UC 方面主张在行气活血的基础上加用白及、白蔹敛疮生肌，以达祛瘀生新的效果[11]。徐喆等[12]通过对国家专利数据库进行分析，发现治疗UC 的高频药物共49 味，其中白及排名第5，在多种治疗UC 的中药复方中被频繁使用。

本研究利用网络药理学探究白及治疗UC 的作用机制，提示中药白及可以通过多成分、多靶点发挥治疗UC 的作用，其中主要的活性成分包括1-4 叔丁基苄基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-对羟基苄基-4-甲氧基-9，10-二氢菲、4，7-二羟基-1-对羟基苄基-2-甲氧基-9，10-二氢菲、菲螺醇，后四种活性物质都属于菲类化合物，其中二氢菲类化合物是白及块茎中含量最多的化合物，也是白及中的主要活性成分[13]，具有抗炎、抗癌等药理作用[14]。俞苏杭等[15]研究证实白及中的菲类化合物大多对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌以及枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有中等强度的抗菌作用。

PPI 网络互作分析结果提示，白及可能通过作用于CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC 等核心靶点来治疗UC。细胞周期蛋白（cyclin D1，CCDND1）作为重要调节因子参与调控细胞周期，通过使周期抑制蛋白失活促进细胞由C1 向S 期转变，从而促进细胞的增殖和生长，以此加速组织的修复促进创面愈合[16-17]。雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）是一种参与多种细胞信号传递的转录因子，具有促进基因转录的功能[18]，可以改变组织细胞的增殖和分化，减轻疼痛的传导[19]。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGFR）是跨膜酪氨酸激酶受体表皮受体家族的成员，可以介导细胞分化、增殖、生长和迁移，组织损伤时刺激EGFR 表达上调，EGFR 激活后可以减轻早期肠道炎症，促进结直肠伤口的愈合[20]。HRAS 属于Ras 家族中的一员，是细胞外向细胞核传递生长信号的关键调节蛋白，激活Ras可以上调细胞生长，诱导其转化[21]。HSP90AA1 可特异性激活细胞毒T 细胞，HSP90AA1 表达与白介素6（IL-6）表达成正相关，通过抑制HSP90AA1 可以抑制细胞免疫并减少炎症因子的分泌[22]。ERBB2 编码HER-2，HER-2 在免疫微环境调节中起着重要作用，HER-2 与酪氨酸激酶结合后可通过激活PI3KAkt 通路和MAPK 通路改善炎症反应[23]。SRC 蛋白具有酪氨酸蛋白激酶活性，参与细胞内外重要信号的传递，参与生物活动的周期转录、细胞粘附、免疫反应、细胞周期等过程的调控，抑制SRC 磷酸化可以抑制缺氧诱导因子的表达，从而减轻炎症反应[24]，并且SRC-3 具有促进肠道黏液分泌的功能，可以保护肠道免受肠腔内细菌的侵袭、抑制毒素的扩散[25]。综上所述，白及可能通过调节上述靶点蛋白的功能，减轻肠道炎症反应、调节免疫功能、抑制细菌侵袭、促进溃疡愈合进而达到治疗UC 的目的。

GO 功能富集分析结果提示，白及治疗UC 的机制可能与促进质膜、胞浆、细胞质的生成，正向调节信号转导、肽基-酪氨酸磷酸化、蛋白磷酸化等生物过程，促进蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白质结合、ATP 能量结合等功能相关。KEGG 通路富集分析结果提示PI3K-Akt、癌症中的蛋白聚糖、前列腺肿瘤、Rap1、MAPK 等信号通路与白及治疗UC密切相关。PI3K/Akt/核因子κB（NF-κB）与UC 进展关系密切[26]，抑制PI3K/Akt/NF-κB 信号通路可以改善小鼠的UC[27]。线粒体动力学失衡诱发的能量代谢障碍是UC 的核心病理过程，PI3K/Akt 通路可以促进下游抗氧化系统表达谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），加速氧自由基的清除，促进细胞能量代谢恢复[28]。环磷酸腺苷（cAMP）是细胞内多种生理活动和新陈代谢调节的重要信号分子，PKA-Rap1 及Epac1/Rap1 信号通路均可介导cAMP 信号的调节，通过下调Rap1 可以减轻氧化应激损伤[29]。MAPK 信号通路与结肠炎症反应相关，EPK、p38 是MAPK 家族的成员，调节EPK MAPK 通路，可以促进溃疡的愈合[30]，抑制结肠组织中的p38 MAPK，可以减轻炎症反应，促进结肠黏膜修复以及创口愈合[31]。

氢键长度不超过3.5 nm 提示对接结构稳定[32]。本研究分子对接结果中，白及中的菲螺醇与靶点SRC 之间的结合活性最强（-11.15 kcal/mol），菲螺醇与SRC 残基共形成6 个氢键，最短的氢键长度为1.9 nm，最长的氢键长度为2.8 nm，均小于3.5 nm，由此可见，白及中的活性成分与潜在核心靶点蛋白之间能形成稳定的相互作用的氢键，白及可以有效发挥治疗UC 的作用。

综上，本研究提示白及可能通过1-4 叔丁基苄基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-对羟基苄基-4-甲氧基-9，10-二氢菲、4，7-二羟基-1-对羟基苄基-2-甲氧基-9，10-二氢菲、菲螺醇等关键成分，作用于CCND1、ESR1、EGFR 等核心靶点，通过抑制肠道炎症反应、调节肠道免疫功能、促进肠道黏液分泌以及加速肠道溃疡愈合等功能，实现治疗UC 的药理作用。本项研究结果为临床使用白及治疗UC 提供了理论基础，后期可进一步进行体内外实验对该机制进行验证。