六君子汤对COPD 稳定期肺脾气虚证患者p38MAPK/Th17信号通路相关细胞因子表达的影响

王玉喜 姜宜惠 张志伟 董 佳 杨 敏 谢 英

截至2018 年，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）在中国中老年人群的患病率已接近14%，相比2007 年上升了约5%[1]，即将成为世界第三大死亡原因[2]。炎症反应和免疫功能紊乱与COPD 发病关系密切，程清等[3]研究发现，p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38MAPK）在COPD 患者肺泡巨噬细胞中被激活，并与患者肺动脉高压、肺功能等病情严重程度密切相关。同时多项研究表明，COPD 患者外周血、支气管黏膜下层、支气管肺泡灌洗液、气道上皮及肺组织中辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）数量较非COPD 吸烟者和健康人群均有所增加，且Th17 细胞数量越多，患者气流受限程度越严重[4-5]。六君子汤是临床常用中药方剂，具有健脾益气、和中止呕、化痰止咳等功效。本研究通过观察六君子汤对COPD 稳定期肺脾气虚证患者的临床疗效及p38MAPK/Th17 信号通路相关细胞因子表达的影响，探讨六君子汤治疗COPD 稳定期肺脾气虚证可能的作用靶点。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2021 年12 月至2022 年9 月在杭州市临安区中医院呼吸科就诊的COPD 稳定期肺脾气虚证患者92 例，按随机数字表法随机分为实验组和对照组，每组46 例。本研究经杭州市临安区中医院伦理委员会审核通过（批件号：lazyyII202003 10-01），患者均签署知情同意书。

1.2 纳入、排除及退出标准 纳入标准：（1）西医诊断符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2021 年修订版）》[6]、《COPD 诊断、治疗与预防全球策略》[7]COPD诊断标准；（2）中医辨证分型符合2002 年《中药新药临床研究指导原则》[8]和全国中医药高等院校教材《中医内科学》[9]肺脾气虚证标准。（3）病情处于稳定期，COPD 分级为Ⅰ～Ⅱ级者[6]。排除标准：（1）入组前4 周内因COPD 急性加重住院的患者；（2）预计生存期不超过半年的患者；（3）其他胸肺疾患（如支气管哮喘、肺结核等）者；（4）合并其他脏器较严重的原发性疾病者。退出标准：（1）因已知或未知因素，患者不愿或不可能再继续进行临床试验；（2）治疗期间出现严重不良事件（如过敏反应、器官功能损伤、心血管事件等），根据医生判断应停止试验者。

2 方 法

2.1 治疗方法 两组患者均给予西医常规治疗：布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂（瑞典阿斯利康制药有限 公 司，规 格：160 μg/4.5 μg/吸×60 吸，批 号20210105、20220125），1 次1 吸，1 天2 次；噻托溴铵粉吸入剂（德国勃林格殷格翰制药有限公司，规格：18 μg×10 粒；批号20210502、20220602），1 次1 吸，1天1 次。对照组在西医常规治疗基础上予安慰颗粒剂（培力药业有限公司，批号20201244），由煎药室统一制成水剂，真空包装，每袋200 mL，1 次1 袋，1 天2 次，早晚饭后温服。实验组在西医常规治疗基础上加服六君子汤（党参15～30 g，茯苓15 g，炒白术15～30 g，半夏9～12 g，陈皮9～12 g，炙甘草6 g），中药购于铜陵禾田中药饮片股份有限公司（批号依次为20210501、20210312、20210510、20210301、20210415、20210101），由煎药室统一代煎成200 mL 1 袋，1 次1 袋，1 天2 次，早晚饭后温服。两组疗程均为3 个月，若在治疗期间患者出现急性加重等病情变化，按照指南提出的规范治疗方案予以相应治疗[6]。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 中医证候积分 参考《中药新药临床研究指导原则》[8]拟定，主症为咳嗽、咯痰、喘息、气短，按无、轻、中、重分别予0、2、4、6 分；次症为乏力、自汗，按无、轻、中、重分别予0、1、2、3 分（见表1）。取总分即为中医证候积分，分值越高，症状越重。证候积分减少率=（治疗前证候积分-治疗后证候积分）/治疗前证候积分×100%。

表1 COPD 稳定期肺脾气虚证患者中医证候积分评分标准

2.2.2 肺功能检查 采用德国耶格肺功能仪（德国Vyaire Medical GmbH 伟业安医疗器械公司，型号MasterScreen）统一评估患者治疗前后1 s 用力呼气容积/用力肺活量（FEV1/FVC）、FEV1 占预计值百分比（FEV1%）。重复3 次，取最佳值。

2.2.3 COPD 临床问卷（CCQ）评分 两组患者采用CCQ[10]进行治疗前后生存质量评分。评分表由10 个项目组成：症状4 项，功能状态4 项，精神状态2 项。每项记0～6 分，分数越高表示生存质量越差。

2.2.4 COPD 急性加重次数 急性加重严重程度[11]：（1）轻度：呼吸症状加重，可通过增加药物剂量控制；（2）中度：需要使用全身糖皮质激素和（或）抗生素治疗；（3）重度：需要住院或至急诊治疗。观察记录研究期间轻度及以上急性加重次数，若两次间隔时间在5 d 内则算为1 次。

2.2.5 外周血单个核细胞分离 采集患者清晨空腹静脉血5 mL，肝素抗凝。按照单个核细胞分离试剂（美国SIGMA 公司，批号191104）说明书操作。最终取底部的单个核细胞沉淀经0.4%台盼蓝染色，活细胞＞90%可用。

2.2.6 Th17 细胞水平测定 取分离得到的单个核细胞，根据Th17 细胞检测试剂盒（美国BD 公司，批号200916）说明书配置抗体标记的细胞悬液，采用流式细胞仪（美国BD 公司，型号BD FACS Canto Plus）测定Th17 细胞水平。

2.2.7 外周血单个核细胞p38MAPK 检测 取分离得到的单个核细胞，根据Trizol 试剂（美国Qiagen 公司，批号190525）和逆转录试剂盒（美国Qiagen 公司，批号190117）说明书提取总RNA 并逆转录为cDNA。根据2×SYBR Green PCR Master Mix（北京康为世纪公司，批号200110）说明书配置反应体系，采用实时荧光定量PCR 检测系统（美国ABI 公司，型号7500）进行分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用2-△△Ct值表示p38MAPK 相对表达量。引物序列：p38-MAPK-F：AAGTTCCTGTCCACATTGCC；p38MAPK-R：TGGATTCAGTGTCAAGCTGC。GAPDH-F：TCAACAGCGACACCCACTCC；GAPDH-R：TGAGGTCCACCACCCTGTTG。

2.2.8 血清细胞因子水平检测 采集患者外周静脉血2 mL，肝素抗凝。按照酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂（美国R&D 公司，批号20201201、20210311、202110101、20210415、20210715、20210201） 说明书操作，采用酶标仪（美国Benchmark 公司，型号MR9600）于450 nm 波长下测定白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-22（IL-22）、白细胞介素-23（IL-23）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。

2.3 临床疗效评价[8]按中医证候积分评价临床疗效。临床控制：症状体征消失/基本消失，证候积分减少率≥95%；显效：症状体征明显改善，证候积分减少率≥70%；有效：症状体征有所好转，证候积分减少率≥30%；无效：症状体征无明显改善，甚至加重，证候积分减少率＜30%。总有效率=（临床控制例数+显效例数+有效例数）/总例数×100%。

2.4 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t 检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 两组COPD 稳定期患者一般资料比较 两组患者均完成治疗，无退出病例。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表2。

表2 两组COPD 稳定期患者一般资料比较

3.2 两组COPD 稳定期患者中医证候积分、肺功能、CCQ 评分和急性加重次数比较 与治疗前比较，两组患者治疗后中医证候积分、CCQ 评分和均降低，肺功能改善（P＜0.05），且实验组效果优于对照组（P 均＜0.01）。实验组急性加重次数低于对照组（P＜0.01）。见表3。

表3 两组COPD 稳定期患者临床观察指标比较（±s）

表3 两组COPD 稳定期患者临床观察指标比较（±s）

注：对照组给予布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂加安慰剂治疗；实验组给予六君子汤联合布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂治疗；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；FEV1/FVC 为1 秒钟用力呼气容积/用力肺活量；FEV1%为FEV1占预计值百分比；CCQ 为COPD 临床问卷；与同组治疗前比较，aP＜0.05

组别实验组对照组t 值P 值例数46 46中医证候积分（分） FEV1/FVC FEV1% CCQ 评分（分）治疗前17.61±5.99 17.33±4.62 0.253 0.801治疗后6.52±1.53a 9.23±2.45a 6.377＜0.001治疗前54.93±10.89 52.50±13.30 0.961 0.339治疗后64.48±11.97a 58.07±9.80a 2.812 0.006治疗前58.43±12.71 57.01±13.81 0.518 0.606治疗后65.52±11.65a 61.80±12.78a 2.693 0.009治疗前3.88±0.58 3.94±0.41 0.620 0.537治疗后1.77±0.12a 2.44±0.59a 7.563＜0.001急性加重次数（次）0.72±0.62 1.22±0.81 3.313 0.001

3.3 两组COPD 稳定期患者外周血Th17 细胞水平比较 与治疗前比较，两组患者治疗后外周血Th17细胞水平均明显降低（P＜0.05），且实验组效果优于对照组（P＜0.01）。见表4。

表4 两组COPD 稳定期患者外周血Th17 细胞水平比较（%，±s）

表4 两组COPD 稳定期患者外周血Th17 细胞水平比较（%，±s）

注：对照组给予布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂加安慰剂治疗；实验组给予六君子汤联合布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂治疗；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；Th17 为辅助性T 细胞17；与同组治疗前比较，aP＜0.05

组别实验组对照组t 值P 值例数46 46治疗前6.20±1.01 6.20±1.00 0.009 0.993治疗后2.18±0.81a 3.41±0.58a 8.350＜0.001

3.4 两组COPD 稳定期患者外周血单个核细胞p38MAPK 表达比较 与治疗前比较，两组患者治疗后外周血单个核细胞p38MAPK 水平均下降（P＜0.05），且实验组效果更明显（P＜0.01）。见表5。

表5 两组COPD 稳定期患者外周血单个核细胞p38MAPK 表达水平比较（±s）

注：对照组给予布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂加安慰剂治疗；实验组给予六君子汤联合布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂治疗；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；p38MAPK 为p38 丝裂原活化蛋白激酶；与同组治疗前比较，aP＜0.05

组别实验组对照组t 值P 值例数46 46治疗前49.79±5.54 49.70±4.53 0.089 0.930治疗后40.79±3.83a 44.36±5.26a 3.727＜0.001

3.5 两组COPD 稳定期患者血清细胞因子水平比较与治疗前比较，两组患者治疗后血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α 水平均降低（P＜0.05），且实验组低于对照组（P＜0.01）。见表6。

表6 两组COPD 稳定期患者血清细胞因子水平比较（ng/L，±s）

表6 两组COPD 稳定期患者血清细胞因子水平比较（ng/L，±s）

注：对照组给予布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂加安慰剂治疗；实验组给予六君子汤联合布地奈德福莫特罗吸入粉雾剂和噻托溴铵粉吸入剂治疗；COPD 为慢性阻塞性肺疾病；IL-6 为白细胞介素-6；IL-8 为白细胞介素-8；IL-17 为白细胞介素-17；IL-22 为白细胞介素-22；IL-23 为白细胞介素-23；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；与同组治疗前比较，aP＜0.05

组别实验组对照组t 值P 值例数46 46治疗前52.57±8.01 53.06±8.78 0.293 0.771 IL-6 IL-8 IL-17治疗后25.64±6.84a 38.10±7.91a 20.914＜0.001治疗前74.44±6.84 73.39±7.23 0.817 0.420治疗后45.35±4.57a 56.89±6.38a 16.060＜0.001治疗前42.93±5.01 41.78±6.28 0.235 0.815治疗后21.37±4.91a 30.59±5.24a 15.654＜0.001组别实验组对照组t 值P 值例数46 46治疗前23.38±3.45 22.85±2.22 0.227 0.822 IL-22 IL-23 TNF-α治疗后9.67±2.12a 15.55±3.49a 10.874＜0.001治疗前98.44±13.48 99.49±12.11 0.433 0.667治疗后56.93±6.93a 73.23±8.36a 18.976＜0.001治疗前46.73±15.31 48.21±13.56 1.710 0.097治疗后19.98±6.94a 29.37±9.81a 20.743＜0.001

3.6 两组COPD 稳定期患者临床疗效比较 实验组总有效率（93.48%）优于对照组（78.26%）（P＜0.05）。见表7。

表7 两组COPD 稳定期患者临床疗效比较[例（%）]

4 讨 论

中医认为，COPD 的主要病因为气血虚弱、外邪入侵、痰湿内生，病位首先在肺，继而延及脾、肾，又根据其喘息、气促、咳嗽、咯痰等症状归属于“肺胀、喘证”范畴。《医宗金鉴》云：“肺胀者，喘满而不舒者也，方治胸中胀满不舒，按之如堵，气滞之为病。”《临证指南医案》记载：“肺胀，心胸支满，不能舒胸，时作似哮痰鸣声，每于此时皆喘不能卧者，为肺胀也，当吐之。”李瑞祥等[12]研究发现COPD 急性期多以邪实为主，稳定期多以虚证为主，且以脾肺虚多见。本研究显示，六君子汤能显著减轻COPD 脾肺气虚证患者临床症状、降低急性加重次数、改善肺功能、提高生活质量，与以往研究结果一致[13-14]。六君子汤中君药党参归肺脾二经，性甘平，可补益肺脾且作用缓和，常用于慢性疾病的治疗。茯苓配白术健脾益气、利水渗湿；陈皮祛湿化痰、宽胸行气；半夏健脾化湿、降逆止呕；此五药为臣，既杜生痰之源，又消已生之痰。甘草调和诸药，补益气血。全方共奏补肺健脾，燥湿化痰之功效，可以从根本上调节慢阻肺患者痰、瘀、虚的基本病机，标本兼治。

p38MAPK/Th17 信号通路在炎症反应的发生和维持阶段都扮演着重要角色。CD4+T 淋巴细胞在受到促炎因子（如IL-6、TNF-α、IL-23）的刺激后可以转化为Th17 细胞，后者主要分泌IL-22 和IL-17 等细胞因子[15]。IL-17 可刺激中性粒细胞分泌IL-6、IL-8 等细胞因子，调节气道内肺巨噬细胞的趋化和激活，将炎症刺激信号不断级联放大，加重肺损伤；IL-22 一方面可通过增强TNF-α 分子下游的信号转导途径从而起到促进气道炎症的作用，另一方面正反馈促进Th17 细胞的继续分化成熟[16]。同时IL-17 可与其相应受体结合激活下游p38MAPK 信号通路[17]。研究[18]发现，p38MAPK 信号通路参与了COPD 患者体内中性粒细胞介导的炎症反应，抑制p38MAPK 活性可显著抑制巨噬细胞和中性粒细胞以及细胞因子的合成，减轻COPD 患者气道炎症，是COPD 治疗的重要靶点。有研究[19-20]表明，COPD 患者血清IL-23 浓度升高，且程度与疾病进展相关，IL-6 和IL-17 可通过刺激支气管上皮细胞，导致气道黏液分泌失衡，引起COPD。本研究显示，服用六君子汤后，COPD 脾肺气虚证患者外周血单个核细胞中p38MAPK 表达水平降低，Th17 水平下调，血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α 等细胞因子水平也均有不同程度的降低（P＜0.05）。从药理学角度分析，党参具有改善肺泡相关物质结构和功能的作用，其中含有的多糖能提高机体的抗应激和抗缺氧能力，增加机体免疫力；白术中的内酯类成分具有抗氧化、抗炎镇痛的功效，可以清除过量自由基，减缓COPD 的氧化应激过程，进而保护肺组织；茯苓中的β-茯苓聚糖可提高肿瘤坏死因子、白细胞介素-2 和自然杀伤细胞的活性，增强细胞免疫功能而起到抑制慢性炎症、抗肿瘤的作用；陈皮挥发油中的柠檬烯具有较强的抗菌作用；半夏提取物可通过抑制TNF-α 等炎症因子的释放从而上调肺水通道蛋白-5 的表达，减轻肺部炎症，起到肺保护作用[21-23]。

综上所述，我们认为六君子汤治疗COPD 脾肺气虚证，主要通过抑制p38MAPK/Th17 信号通路及其相关细胞因子表达而发挥作用。