肺癌合并肺结核患者病变组织中CTLA-4、PD-L1 的表达与临床病理特征的相关性研究

施 佳 王天香 耿艳华 梁木凤 王 新

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种传染病，根据《2022 年全球结核病报告》，2021 年有1060万人患结核病，并且有160 万人死于结核病[1]。研究[2]表明，肺结核与癌症风险增加有关，其中与肺癌相关性最高。近年来，肿瘤的免疫治疗获得了广泛研究，其中相关靶点程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、程序性死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的免疫检查点抑制剂已经成为肺癌的一线治疗用药，并且为患者提供了生存益处[3-4]。研究[5-6]表明，结核感染和肺癌均可发生T 细胞相关的免疫逃逸，使共抑制分子的表达增加。因此，本研究探讨肺癌合并肺结核患者病变组织中CTLA-4、PDL1 的表达与临床病理特征的关系，旨在进一步探索结核感染与肺癌发生发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集杭州市红十字会医院2013—2022 年胸外科及结核外科收治的96 例患者为研究对象，其中肺癌合并肺结核患者38 例（肺癌合并肺结核组）、单纯肺结核患者29 例（肺结核组）、单纯肺癌患者29 例（肺癌组）。本研究获得医院伦理委员会审核通过，批准编号：【2022】研审第（79）号。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）所有患者均经临床、影像学检查及病理诊断证实[7-8]，肺癌合并肺结核组需患者肺结核及肺癌病灶位于同一侧肺；（2）首次接受手术治疗者；（3）临床资料完整。排除标准：（1）术前接受抗肿瘤治疗者；（2）伴其他部位原发性肿瘤者；（3）合并自身免疫性疾病的患者。

1.3 免疫组织化学实验 分别取肺结核组患者的结核病灶组织及肺癌组和肺癌合并肺结核组患者的肺癌病灶组织作为研究标本，经10%中性甲醛固定，按常规标准石蜡包埋、制片，并进行苏木精伊红染色（HE）和免疫组化染色。免疫组化实验片经过烤片、脱蜡、3%双氧水封闭、乙二胺四乙酸（EDTA）高压修复20 min 后，按照SP 法二抗试剂盒进行孵育，二甲基联苯胺（DAB）显色，苏木精衬染，DM1000 光学显微镜（德国徕卡公司）下观测CTLA-4、PD-L1 的蛋白表达。浓缩型兔抗人CTLA-4 抗体（一抗，工作浓度：1∶500，批号1005930-6）购自英国Abcam 公司；PDL1（批号220507C02X）购自厦门艾德生物公司；羊抗兔/小鼠IgG 聚合物（二抗，批号22011）购自广州安必平医药科技股份有限公司；抗体稀释剂（批号23081401）、DAB 显色剂（批号221101）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 结果判读[9]CTLA-4 和PD-L1 定位于细胞膜，出现完整的棕黄色膜染色判定为阳性细胞。随机选取5 个高倍镜视野，按阳性细胞占总细胞数的百分比计分：＜3%为0 分；3%～9%为1 分；10%～24%为2分，≥25%为3 分。阳性细胞着色程度计分：阴性为0分，弱阳性为1 分，中等阳性为2 分，强阳性为3 分。将上述两项评分的乘积作为最终结果：0～2 分为阴性表达，3～9 分为阳性表达。本实验经由两名经验丰富的病理医生独立阅片并进行判读。

1.5 统计学方法 应用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，符合正态分布和方差齐性的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t 检验或非参数检验；计数资料以例（%）表示，采用卡方检验或Fisher精确检验。两组间相关性分析，符合正态分布者，使用Spearman 相关性分析，不符合正态分布者使用Kendall's tau-b 等级相关性分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组患者一般资料比较 96 例患者中男48例，女48 例，年龄18～84（52.54±15.70）岁，中位年龄55.5 岁。肺癌合并肺结核组38 例，其中男21 例，女17 例，年龄24～74（57.84±11.41）岁；肺结核组29 例，其中男18 例，女11 例，年龄18～46（37.76±2.13）岁；肺癌组29 例，其中男10 例，女19 例，年龄32～84（60.38±2.65）岁，三组性别、年龄比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。肺癌合并肺结核组鳞癌11 例，腺癌27 例[8]；肿瘤分化程度高分化11 例，中+低分化27 例[8]；肿瘤最大径（2.67±1.66）cm，≥2.7 cm 16 例，＜2.7 cm 22 例；TNM 分期[8]Ⅰ期25 例，Ⅱ～Ⅲ期13例。肺癌组鳞癌4 例，腺癌25 例；肿瘤分化程度高分化11 例，中+低分化18 例；肿瘤最大径（1.85±0.20）cm，≥1.85 cm 10 例，＜1.85 cm 19 例；TNM 分期Ⅰ期26例，Ⅱ期3 例。

2.2 三组患者病变组织中CTLA-4、PD-L1 阳性表达率比较 免疫组化结果显示，CTLA-4 表达于肺癌及肺结核病灶的淋巴细胞，PD-L1 表达于肺结核病灶的间质巨噬细胞及肺癌病灶的肿瘤细胞及间质巨噬细胞。CTLA-4 在肺癌合并肺结核组、肺结核组、肺癌组患者病变组织淋巴细胞中的阳性表达率分别为65.79%、24.14%、20.70%，肺癌合并肺结核组的阳性表达率高于其余两组，差异均具统计学意义（均P＜0.01）。PD-L1 在肺癌组、肺癌合并肺结核组患者的肿瘤细胞中阳性表达率分别为6.90%、10.53%，两者比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。PD-L1 在肺结核组、肺癌组、肺癌合并肺结核组患者病变组织间质巨噬细胞中的阳性表达率分别为48.28%、31.03%、39.47%，肺癌合并肺结核组与其他两组差异无统计学意义（均P＞0.05）。见图1、表1。

表1 肺结核组、肺癌组、肺癌合并肺结核组患者病变组织中CTLA-4、PD-L1 阳性表达率比较[例（%）]

图1 肺结核组、肺癌组、肺癌合并肺结核组CTLA-4、PD-L1 的表达情况及肺癌合并肺结核组病变组织HE 染色情况

2.3 肺癌合并肺结核组患者病变组织中CTLA-4、PD-L1 表达情况与临床病理特征的关系 CTLA-4阳性表达率在鳞癌、低+中分化癌、肿瘤最大径≥2.7 cm 的病例中显著高于腺癌、高分化癌、肿瘤最大径＜2.7 cm 的病例（均P＜0.05）；CTLA-4 阳性表达率与年龄、性别、淋巴结转移、TNM 分期无关（均P＞0.05）。肿瘤细胞的PD-L1 阳性表达率在TNM 分期Ⅱ～Ⅲ期的病例中高于TNM 分期Ⅰ期的病例（P＜0.05），与其他特征无关（均P＞0.05）。间质中的PDL1 阳性表达率在不同的临床病理特征中的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 肺癌合并肺结核组患者病变组织中CTLA-4、PD-L1 表达情况与临床病理特征的关系[例（%）]

2.4 肺癌合并肺结核组患者病变组织中CTLA-4、PD-L1 表达与临床病理特征的相关性 CTLA-4 表达与肿瘤类型具有相关性，相关系数为0.460，P＜0.05；与肿瘤分化程度和肿瘤大小相关系数分别为0.268、0.395，无明显相关性（P 均＞0.05）。肿瘤细胞中PD-L1 表达与肿瘤分期无相关性，相关系数为0.105，P＞0.05。见表3。

表3 肺癌合并肺结核组患者病变组织中CTLA-4、PD-L1表达与临床病理特征的相关性

2.5 肺癌合并肺结核组患者病变组织中CTLA-4、PD-L1 表达的相关性 肺癌合并肺结核组患者肿瘤细胞中PD-L1 表达与淋巴细胞中CTLA-4 表达之间的相关系数为0.067，间质巨噬细胞中PD-L1 表达与淋巴细胞中CTLA-4 表达之间的相关系数为0.128，均无显著相关性（P 均＞0.05）。见表4。

表4 肺癌合并肺结核组患者病变组织中CTLA-4与肿瘤/间质中PD-L1 表达的相关性

3 讨 论

免疫耐受和逃逸近年来在肿瘤和慢性感染方面均是研究热点。结核感染与肿瘤微环境在免疫方面具有很多相似性，两者均可以导致T 细胞进行性损害，使免疫细胞表面的免疫抑制分子表达升高，导致机体发生免疫逃逸，促进疾病的发生发展[10]，因此结核感染可能为肿瘤的发展提供了有利的微环境。

CTLA-4 是免疫球蛋白超家族成员，表达于T 淋巴细胞表面，通过与T 细胞表面的共刺激分子CD28竞争结合抗原提呈细胞表面的配体B7 分子（CD80、CD86）发挥作用，结合后产生抑制性信号，抑制T 细胞的增殖与活化[11]。CTLA-4 抑制T 细胞增殖与活化的作用，可能与白细胞介素-2（IL-2）产生减少[12]和B淋巴细胞瘤-2 基因（Bcl-2）等抗凋亡因子表达上调有关[13]。研究[14]表明，CTLA-4 在乙肝等慢性感染疾病中存在差异表达，并且参与了病原体的致病过程。在小鼠实验中证实了CTLA-4 阻断可增强慢性感染中的T 细胞反应[15]。结核杆菌在人体中被巨噬细胞吞噬之后，刺激T 细胞增殖，使Th1/Th2 型T 细胞平衡失调，CD8+T 细胞表面的CTLA-4 等共抑制分子表达增加[5]。上述T 细胞平衡失调现象在肺癌患者体内亦被发现[16-17]。本研究发现，三组患者病变组织中CTLA-4 表达于肺结核及肺癌病灶的淋巴细胞，并且肺癌合并肺结核组的表达率显著高于其余两组（P＜0.01），提示结核感染可能促使CTLA-4 在肺癌组织中的表达升高。在结核肉芽肿以及肿瘤微环境中，巨噬细胞逐渐转化为M2 型，M2 巨噬细胞有助于促进血管的生成和免疫抑制因子的表达，促进肿瘤生长[18]。实验[19]证实CTLA-4 表达的上调能促进结核相关巨噬细胞由M1 向M2 极化。由此推测在肺癌合并肺结核的病例中，结核免疫导致CTLA-4 的表达升高，有助于肿瘤微环境中的巨噬细胞向M2 型极化。综上所述，CTLA-4 在免疫调节中主要发挥了负性作用，并且结核感染可能是通过提高CTLA-4 的表达和巨噬细胞向M2 型极化这两个途径促进免疫逃逸和形成适宜微环境，促进肺癌的发生发展。

PD-1/PD-L1 是协同抑制分子，PD-L1 与CTLA-4 的作用相似，PD-L1 作为PD-1 的配体主要表达于肿瘤细胞与抗原提呈细胞的表面，两者结合后能够通过启动胞内磷酸化级联反应抑制T 细胞的活化和增殖，使免疫细胞耐受并减弱其抗肿瘤免疫反应的能力[20]。PD-L1 在活动性肺结核患者的巨噬细胞上表达，并且当PD-1/PD-L1 通路阻断时，巨噬细胞的吞噬作用显著增加，说明在结核患者中此通路抑制巨噬细胞的功能发挥[21]。在一项结核促进肿瘤发展的研究中发现，结核分枝杆菌可以促进CD4+Foxp3+调节性T 细胞（Tregs）增殖，使非小细胞肺癌的肿瘤细胞增长，诱导PD-L1 表达，促进免疫逃逸[22]。也有相关研究提出，PD-1/PD-L1 信号通路是结核感染导致T 细胞耗竭和促进肿瘤在肺中转移的关键途径[23]。本研究显示，PD-L1 在TNM 分期更高的肺癌合并肺结核病例中表达更高，说明PD-L1 的表达升高可能有利于肿瘤的发展。但PD-L1 与肺结核促进肺癌发展的相关性需要更多实验来证实。

CTLA-4 和PD-L1 作为重要的免疫负性分子，均通过受体-配体结合的方式发挥抑制T 细胞免疫和促进肿瘤发展的作用，相关的免疫检查点抑制剂已广泛应用。但免疫抑制通路具有多样性，不同人、不同疾病的机制都可能不同，因此单靶点抗体药物具有一定的局限性。目前临床实验发现，PD-L1 和CTLA-4 的联合靶向治疗比单独治疗更有效[24]，并且单独阻断PD-1/PD-L1 会导致CTLA-4 表达上调，从而发生治疗抵抗[25]，由此可以推测两者可能存在协同作用，由它们导致的双重免疫抑制可以促进疾病的发展。但本研究样本量较小，有一定的局限性，两者之间的相关性有待进一步研究探讨。

综上所述，我们推测CTLA-4、PD-L1 均可能在结核感染过程中发生免疫负性调节，进而促进肺癌发生发展。由此，可以认为CTLA-4、PD-L1 是未来免疫调节治疗的潜在药物靶点，可能对肺癌的治疗以及结核等慢性感染的治疗有积极意义，可能干预结核进一步发展为癌症的进程。