苍术素调节腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1信号通路对白细胞介素-1β诱导软骨细胞自噬和凋亡的影响

沈晓娟，程磊，刘琳

作者单位：上海中医药大学附属龙华医院药学部，上海200032

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性退行性疾病，主要病理改变表现为软骨退化、骨赘形成、滑膜炎症，随着年龄的增长，患病率呈升高趋势，严重影响病人身心健康，OA 的发病机制尚不完全清楚，软骨细胞凋亡在OA 的发展中发挥重要作用，抑制细胞凋亡是治疗OA 的一个方向［1-2］。自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，研究显示，自噬参与OA 的进展，增强自噬可以抑制软骨细胞凋亡，延缓骨关节炎的进展［3］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种能量传感器，可激活Unc-51 样自噬激活蛋白酶（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）正调控自噬，激活AMPK 增强自噬，抑制OA 软骨细胞凋亡［4］。沉默信息调节因子1（silent message modulator 1，SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的去乙酰化酶，磷酸化的AMPK 可提高细胞内NAD+浓度，激活SIRT1 的表达，激活AMPK/SIRT1 信号通路，可抑制炎症反应，改善OA 症状［5］。苍术素（atractylodin，ATR）是从苍术中提取有效物质，具有降糖、抗炎、抗氧化及抗肿瘤的作用［6］。研究显示，苍术素可抑制白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）诱导的软骨细胞炎症反应［7］，但其具体作用机制尚不清楚，本研究2022 年1—8 月通过观察苍术素对IL-1β 诱导的软骨细胞自噬及对AMPK/SIRT1信号通路的影响，探索苍术素对IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡与自噬可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂1 周龄SD 雄性乳鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0011。苍术素（HPLC≥98%）购自四川成都/思克生物；重组大鼠IL-1β（GS4468）购自北京百奥莱博科技有限公司；AMPK 抑制剂compound C（纯度99.91%）购自美国MCE 公司；Annexin VFITC/PI 凋亡试剂盒（CA1020）、噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒（M1020）、单丹磺酰尸胺（montane sulfonyl cadaverine，MDC）试剂盒（G0170）、TUNEL 凋亡检测试剂盒（绿色荧光）（T2130）购自北京索莱宝生物科技有限公司；LC3（AL221）、Beclin-1（AF5123）、Atg5（AF2269）、AMPK（AF1627）、p-AMPK（AF2677）、SIRT1（AF5300）抗体购自碧云天生物科技有限公司，ULK1（ab167139）、p-ULK1（ab203207）抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1软骨细胞的分离与鉴定 1 周龄SD 乳鼠麻醉后处死，根据参考文献［8］，无菌条件下取软骨组织，采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶两步酶消化法提取软骨细胞，原代细胞培养3 d 后，显微镜观察细胞生长情况，采用甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ）免疫荧光染色进行鉴定，鉴定过的细胞传代培养，选取第3代细胞进行后续实验。

1.2.2苍术素浓度的筛选 第3代软骨细胞融合至80%左右时，按照4×104个接种于96 孔板中，使用不同浓度的苍术素（0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）处理软骨细胞，同时加入10 μg/L 的IL-1β 共同处理24 h 后，另设正常培养的细胞为对照组，加入20 μL 的MTT 溶液，孵育4 h 后，加入DMSO 终止反应，检测490 nm处的光密度值（OD值）。

1.2.3细胞培养及分组 将软骨细胞随机分成4组，分别为对照组、IL-1β 组、苍术素组（苍术素组）、苍术素+AMPK 抑制剂组（苍术素+compound C 组），其中IL-1β 组使用10 μg/L 的IL-1β［8］诱导24 h，建立细胞模型；苍术素组使用20 μmol/L 的苍术素与10 μg/L 的IL-1β 共同处理细胞24 h，苍术素+compound C 组在建立细胞模型前，使用50 μmol/L 的compound C［9］预处理2h，再使用20 μmol/L 的苍术素与10 μg/L 的IL-1β 共同处理细胞24 h，对照组用等量的PBS处理细胞。

1.2.4细胞凋亡检测 将各组处理的软骨细胞按照4×104个接种于96 孔板中，培养24 h 后，使用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡。

另取各组处理的软骨细胞按照1×104个细胞接种于无菌盖玻片上，培养24 h 后，使用预冷的甲醇固定10 min，加入TUNEL 反应液，37 ℃，染色1 h，光显微镜下观察并拍照。

1.2.5MDC 染色观察自噬小体 收集各组处理的软骨细胞800 ×g离心5 min，使用Wash buffer 将细胞制成109个/升的细胞悬液，取90 μL细胞悬液加入10 μL的MDC 染色液，避光染色30 min，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6蛋白质印迹法检测细胞中自噬及AMPK/SIRT1 通路相关蛋白表达 使用RIPA 裂解液从各组处理的细胞中提取总蛋白，取30 μg 蛋白SDSPAGE电泳、转膜后封闭，LC3（1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）、Atg5（1∶1 500）、p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 500）、SIRT1（1∶1 000）、ULK1（1∶1 500）、p-ULK1（1∶1 500）抗体，4 ℃孵育过夜，再加入酶标二抗（1∶1 000）室温孵育2 h，ECL 试剂显色，以β-actin为内参，利用Image J软件分析蛋白相对表达。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0 软件进行统计分析，计量资料符以±s表示，数据分布的正态性和方差齐性分别通过Kolmogorov-Smirnov 检验和Levene 检验进行分析（P＞0.05）；方差齐（P＞0.05）时，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验；方差不齐时，组间两两比较采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨细胞的分离与鉴定显微镜下观察显示，分离的原代大鼠软骨细胞培养3 d 后，细胞呈椭圆形或梭形，细胞贴壁生长（图1A），甲苯胺蓝染色显示，细胞核被染成深蓝色，核仁呈蓝紫色，细胞质褐红色（图1B），collagen Ⅱ免疫荧光染色显示，细胞呈绿色（图1C），经DAPI染色细胞核呈蓝色，证明分离的细胞为软骨细胞。

2.2 苍术素对IL-1β诱导的软骨细胞增殖活性的影响与对照组（1.22±0.11）比较，IL-1β 组软骨细胞增殖活性（0.60±0.07）显著降低（F=45.91，P＜0.001）；使用不同浓度苍术素（5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）预处理软骨细胞后，细胞增殖活性增加（0.63±0.07、0.65±0.08、0.78±0.08、0.95±0.09、1.06±0.10），且苍术素浓度在20 μmol/L 以上，可显著促进细胞增殖，因此选择苍术素浓度20 μmol/L进行后续实验。

2.3 苍术素对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响与对照组（2.54±0.82）%比较，IL-1β 组软骨细胞凋亡率（28.46±3.55）%显著升高（P＜0.05）；与IL-1β 组比较，苍术素组软骨细胞凋亡率（14.26±2.45）%显著降低（P＜0.05）；与苍术素组比较，苍术素+compound C组软骨细胞凋亡率（22.36±2.71）%显著升高（P＜0.05）。

TUNEL 染色结果显示，凋亡细胞为绿色，细胞核为蓝色，与对照组比较，IL-1β 组细胞绿色荧光增多，与IL-1β 组比较，苍术素组绿色荧光减少；与苍术素组比较，苍术素+compound C 组绿色荧光增多，见图2。

图2 TUNEL染色观察苍术素对IL-1β诱导的乳鼠软骨细胞凋亡的影响（×1 000）

2.4 苍术素对IL-1β诱导的软骨细胞自噬的影响荧光显微镜下观察显示，MDC 染色自噬小体呈绿色，与对照组相比，IL-1β 组软骨细胞绿色荧光强度减弱；与IL-1β 组相比，苍术素组细胞绿色荧光强度显著增强；与苍术素组比较，苍术素+compound C 组细胞绿色荧光强度减弱，见图3。

图3 乳鼠软骨细胞自噬小体（MDC染色×400）：A为对照组；B为I L-1 β组；C为苍术素组；D为苍术素+C o m p o u n d 组

2.5 苍术素对IL-1β诱导的软骨细胞自噬相关蛋白的影响与对照组比较，IL-1β 组软骨细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与IL-1β 组相比，苍术素组软骨细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与IL-1β+苍术素组比较，苍术素+compound C组软骨细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见图4；表1。

表1 苍术素对IL-1β诱导的软骨细胞LC3、Beclin-1、Atg5表达的影响/± s

表1 苍术素对IL-1β诱导的软骨细胞LC3、Beclin-1、Atg5表达的影响/± s

注：LC3为微管相关蛋白轻链3，Atg5为自噬相关基因-5。①与对照组比较，P＜0.05。②与IL-1β 组比较，P＜0.05。③与苍术素组比较，P＜0.05。

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图4 各组软骨细胞LC3、Atg5、Beclin-1蛋白表达情况

2.6 苍术素对IL-1β诱导的软骨细胞AMPK/SIRT1通路相关蛋白的影响与对照组相比，IL-1β组软骨细胞中p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与IL-1β 组相比，苍术素组软骨细胞中p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与苍术素组比较，苍术素+compound C 组细胞p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），各组之间AMPK、ULK1表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5和表2。

表2 各组软骨细胞SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达/± s

表2 各组软骨细胞SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达/± s

注：AMPK 为腺苷酸活化蛋白激酶，SIRT1 为沉默信息调节因子1，ULK1为Unc-51样自噬激活蛋白酶。①与对照组比较，P＜0.05。②与IL-1β 组比较，P＜0.05。③与苍术素组比较，P＜0.05。

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图5 各组软骨细胞SIRT1、ULK1、p-ULK1、AMPK、p-AMPK蛋白表达情况

3 讨论

IL-1β 是一种促炎细胞因子，可通过调节基质金属蛋白酶与炎症因子表达，诱导软骨细胞凋亡，参与OA 进展，常作为诱导OA 细胞模型的因子［10］。本研究从乳鼠软骨组织分离软骨细胞，经甲苯胺蓝染色和collagen Ⅱ免疫荧光染色证明成功分离软骨细胞。使用IL-1β 处理软骨细胞后，细胞增殖活性降低，凋亡率升高，表明OA 细胞模型建模成功。苍术素为苍术提取物，可以调控炎症反应、氧化应激、肿瘤细胞增殖与迁移等，具有多种药理学作用［11］。研究显示，苍术素抑制核苷酸结合结构域-（nucleotide binding domain，NOD-）样受体蛋白3（like receptor protein 3，NLRP3）炎性体和toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）激活，抑制炎症反应，减轻脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤［12］。蒲博强等［13］发现，苍术提取物可通过下调miR-378c 表达，抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡，促进细胞增殖。本研究使用不同浓度苍术素预处理细胞24h，再使用IL-1β 处理细胞，结果显示细胞增殖活性增加，且在20 μmol/L以上时，细胞增殖活性显著增加，选择20 μmol/L 的苍术素进行后续实验，发现20 μmol/L 的苍术素可显著抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡。这与既往的研究结果［13］一致，再次证实苍术素是OA的潜在治疗药物。

自噬是依赖溶酶体途径对细胞器及大分子物质进行降解的过程，具有维持细胞内稳态的作用，参与细胞凋亡过程［14］。研究显示，自噬参与维持软骨内平衡，参与OA 进展，激活自噬可减轻OA 严重程度［15］。LC3、Beclin-1、Atg5 是自噬通路相关的调控因子，LC3 有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，发生自噬时，LC3-I 转化为LC3-Ⅱ，Beclin-1 可调控自噬前体的形成，Atg5 是自噬活性标志物，与Beclin-1 共同参与正向调控自噬［16］。苍术素参与自噬调节，如在胆管癌细胞中，苍术素可通过诱导自噬，抑制细胞增殖与迁移［17］。本研究结果显示，在10 μg/L IL-1β刺激24 h 后，软骨细胞中自噬小体水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表达水平显著降低，表明IL-1β 诱导的软骨细胞中自噬被抑制；使用20 μmol/L 的苍术素处理细胞后，IL-1β 诱导的软骨细胞自噬小体水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表达水平显著升高，提示苍术素可促进IL-1β 诱导的软骨细胞自噬，降低IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。

AMPK 是细胞ATP 水平的代谢传感器，参与调节细胞能量代谢，AMPK 激活可使其下游底物磷酸化，ULK1 是AMPK 通路的下游分子，参与自噬的起始，SIRT1是NAD+依赖性组蛋白脱乙酰酶，AMPK可促进NAD+的生成，激活SIRT1 因子［18］。研究显示，白果内酯通过激活AMPK/SIRT1/mTOR 通路，抑制IL-1β 诱导的软骨细胞中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧合酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）和基质金属蛋白酶13（Matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的产生［19］。苍术素也参与AMPK/SIRT1 通路的调节，如苍术素通过Sirt1/AMPK 轴诱导的自噬调节减轻癌症厌食恶病质综合征［20］。本研究发现，使用苍术素处理软骨细胞后，p-AMPK、SIRT1、p-ULK1蛋白表达水平显著升高，表明苍术素可能激活SIRT1/AMPK 信号通路。本研究进一步使用AMPK 抑制剂compound C 与苍术素共同处理软骨细胞，结果发现compound C 可逆转苍术素对软骨细胞凋亡的抑制作用，提示苍术素可能通过激活AMPK/SIRT1 信号通路提高IL-1β 诱导的软骨细胞自噬，降低细胞凋亡。

综上所述，苍术素通过激活AMPK/SIRT1 信号通路促进IL-1β 诱导的大鼠软骨细胞自噬，抑制细胞凋亡。但本研究局限于AMPK/SIRT1 信号通路相关的部分蛋白，苍术素的具体作用机制仍须结合动物模型做更深入的研究。