基于球包球填料的液质联用技术应用考察

徐灵佳，郭欣桐

（宁夏职业技术学院，宁夏银川 750021）

随着质谱分析技术迅速发展，液相色谱串联质谱联用系统分析已经成为最广泛应用的蛋白质复合物分离鉴定研究方法[1-3]。而前端采用纳流液相色谱的液质联用方法，更是大大突显了液质联用高效率、高分辨、高灵敏度以及低进样量的优势[4]。因此，如何进一步提高前端色谱分离的效率和效果是目前蛋白质组学分析亟需解决的问题。

球包球填料[5]是一种新型的壳-核色谱填料，它优化了色谱动力学过程，在之前的研究中色谱分离效果良好[6]。通过改变表面纳米小球的壳厚度，可以将色谱填料调整到适宜尺寸的孔隙，从而适用于分离生物大分子。

本实验采用这种新型球包球壳-核式反相色谱填料填充纳流液相色谱柱，探究色谱柱的柱性能，并构建了液质联用平台，探究此平台在牛血清白蛋白酶解产物分析中的应用，从而预测其未来在蛋白质组学分析中的应用潜能。

1 实验部分

1.1 实验材料与试剂

材料：内径100 μm，外径375 μm 的透明涂层毛细管（永年锐沣色谱器件有限公司）。

试剂：乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）、超纯水、尿素、NH4HCO3、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA）、胰蛋白酶。

样品：牛血清白蛋白（BSA）。

1.2 实验仪器及数据处理

实验仪器：Vario EL III 元素分析仪（Elementar，Germany）；日立S-4800 扫描电镜（Hitachi，Japan）；纳流液相色谱串联质谱联用平台由Waters ACQUITY 超高压液相色谱系统（Waters，Milford，MA，USA）和QExactive 高性能台式四级杆-轨道阱质谱仪（Thermo Scientific，USA）组成，分析柱由球包球填料填充而成。

数据处理：将Q-Exactive 质谱分析得到的raw 文件用Proteome Discoverer（Version 1.40，Thermo Fisher）进行检索，数据库为Uniprot-Bovine。

1.3 球包球填料毛细管柱性能检测

1.3.1 柱截面填充情况检测 采用匀浆法填充3 根15 cm 长的球包球填料毛细管柱，每根色谱柱以每2 cm 为1 节点按照垂直于色谱柱方向截断，用扫描电镜观察其柱床填充情况。

1.3.2 球包球填料元素含量分析 将球包球填料（SOS-ODS）、A scentis Express C18、HALO C18（AMT，Inc.）、Kinetex C18（Phenomenex）、Poroshell 120（Agilent）5 种填料各取适量，分2 份包裹在锡箔中，称重之后放入自动样品进样器的旋转式进样盘中进行元素分析。

1.4 纳流液相色谱串联质谱联用系统分析

1.4.1 牛血清白蛋白的酶解 蛋白质酶解样品是通过胰蛋白酶在溶液里酶解标准蛋白而获得的。首先，蛋白质被溶解在8 mol/L 尿素、0.05 mol/L NH4HCO3的溶液中。然后，蛋白质被DTT 分解，被IAA 烷基化。最后，胰蛋白酶以50∶1 的比例加进去，酶解过夜。

1.4.2 纳流液相色谱体系流动相的配制 分别配制流动相，A 相（水相）：H2O+0.1%TFA；B 相（有机相）：ACN+0.1%TFA；C 相：50%ACN。

1.4.3 梯度洗脱 液相的流量为300 nL/min。流动相梯度为0～5 min，2%～10%B；5～85 min，10%～35%B；85～105 min，35%～65%B；105～110 min，65%～95%B；110～120 min，95%B。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱截面的扫描电镜

为了解球包球填料填充的纳流液相色谱柱的柱床微观结构，探求其对色谱分离效能的影响，使用扫描电镜对色谱柱截面进行了观察，见图1。由图1 可以看出，球包球填料高度均一，但由于填料表面布满了纳米小球，表面比较粗糙，纳米小球彼此之间挤压，造成填充柱床中的空腔较多，孔隙较大。柱床中的大孔隙虽然可以降低色谱分离时的背压，提高分离速度，但是对于复杂多肽混合物的分离效果可能不利。

图1 球包球填料毛细管柱的扫描电镜图

2.2 球包球填料元素含量分析

对于反相色谱填料来说，C18 的修饰决定了蛋白多肽等生物分子的保留情况，因此，探究色谱填料的碳载量尤为重要。本实验对球包球填料和4 种商业化的反相色谱填料进行元素分析，见表1。

表1 5 种色谱填料的元素分析表

由表1 可以看出，球包球填料的平均碳载量相对较低，这可能会影响到色谱分离时生物分子的保留情况，可能需要更长的洗脱时间和洗脱梯度才能达到较好的分离效果。

2.3 纳流液相色谱串联质谱联用系统分析

利用球包球填料填充的毛细管柱构建纳流液相色谱串联质谱联用分析平台，对标准蛋白牛血清白蛋白（BSA）酶解进行分离，得到BSA 酶解产物的质谱总离子流图见图2。由图2 可知，球包球填料对小分子多肽的混合物分离效果良好。由图3 可知，在此平台下对BSA 酶解产物进行分析鉴定，肽段匹配很高。通过搜库结果可知，肽段的覆盖率可达63.90%，由此证明了球包球填料高效的色谱分离能力和液质联用在蛋白质组学分析的应用潜能。

图2 BSA 酶解产物的质谱总离子流图

图3 BSA 酶解产物中肽段匹配情况

3 结语

本实验利用球包球填料填充纳流液相色谱分析柱，对其柱床性能进行了简单考察，成功构建了纳流液相色谱串联质谱联用分析平台，并采用液质联用法对牛血清白蛋白酶解产物进行了分析鉴定。球包球填料的纳流液相色谱柱床孔隙较大，可能与其表面过于粗糙有关。球包球填料平均碳载量相对较低，影响生物分子保留，后续还需要进一步优化。尽管如此，球包球填料依旧显示出它在色谱上的高效分离，由其建立的液质联用在蛋白质组学分析上具有巨大应用潜能。