基于香豆素和寡聚芳酰胺的Hg2+荧光探针性能及应用研究

杨永安，王 媛，陈 明，谢一柳，王英伍，许肖云

（1.西华师范大学 环境科学与工程学院，四川 南充 637009；2.四川省遂宁生态环境监测中心站，四川 遂宁 629000；3.西华师范大学 化学化工学院，四川 南充 637009）

汞广泛存在于自然界中，随着人类活动开展和工业进程的加快，汞的消耗量也越来越大。2018年联合国环境署发布的报告表明，全世界每年排放汞数千吨。汞的主要存在形式为单质汞、无机汞和有机汞，进入环境中的无机汞在细菌作用下可转化成毒性更大且难分解的有机汞。汞及其衍生物随食物链进入生物体后，极易与细胞膜或酶蛋白内的巯基结合［1-2］，从而影响细胞的正常代谢和生理功能，且易产生生物富集［3-5］，进而损害心脏、肾脏、中枢神经系统、口腔及皮肤等器官［6-8］，即使很低的浓度也可能会造成永久性破坏［9-11］，导致人体中毒，如水俣病［12］，给人类健康带来巨大伤害［13］。世界卫生组织和我国规定饮用水中的汞不能超过1.0×10-3mg/L［14］。目前，汞已成为最引人关注的环境污染物之一［15］。因此，设计和开发高效、快速且灵敏的汞检测技术愈加紧迫和重要。

目前汞的测定方法有分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、高效液相色谱法以及电化学法等［16-20］，但上述方法存在样品预处理复杂、分析设备昂贵、分析周期长等弊端，难以满足方便、快捷和灵敏的检测要求［21］。荧光法因具有操作简单、成本低、灵敏度高、检出限低等优异性能，受到研究人员的广泛关注［22］。荧光探针的核心是荧光基团，常见的有罗丹明类、萘酰亚胺类、菁类、香豆素类以及吡咯甲川类等［23-27］。其中香豆素因荧光量子产率高、光稳定性好、斯托克斯位移大以及易修饰等优点，被广泛应用于探针设计［28-30］。

已有研究设计并合成了一种基于三中心氢键促进的刚性芳酰胺寡聚体［31-32］。该类分子不仅具有合成简单、原料易得、易纯化和产率高的特点，且因其三中心氢键处于骨架外部，使得羰基伸向环内形成一个富电子空腔，该空腔不仅可选择性地识别某些小分子［33-34］，还对某些金属离子具有很强的络合能力［35-37］。基于对该类新型化合物的结构特性和研究兴趣，本文首次利用寡聚芳酰胺三聚体和3-氨基香豆素高效合成了拥有两个香豆素荧光基团的寡聚芳酰胺分子（Coumarin-oligaramide，COA）（合成路线见图1），并研究了其对Hg2+离子的识别性能及检测机理。最后将其用于实际水样中Hg2+离子的检测，以考察其在环境监测和分离领域的潜在应用价值，为指导和设计更加高效的新型荧光探针奠定基础。

图1 探针COA的合成路线Fig.1 Synthesis route of probe COA

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Cary Eclipse 型荧光分光光度计（美国Agilent 公司）；AVANCE-400 型核磁共振仪（四甲基硅烷为内标，CDCl3作溶剂）、INVENIO R 型傅里叶变换红外光谱仪（IR，美国Bruker 公司）；Q-TOF-Premier spectrometer 型质谱仪（ESI-HRMS，美国Waters 公司）；AFS-9130型原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司）。

3-氨基香豆素、乙二胺四乙酸四钠盐水合物（EDTA）、锌标准溶液（1.0 mg/L）、KNO3、NaNO3、Ca（NO3）2·4H2O、Mg（NO3）2·6H2O、Cu（NO3）2·3H2O、Zn（NO3）2·6H2O、Pb（NO3）2、Cd（NO3）2·4H2O、Fe（NO3）3·9H2O、Mn（NO3）2·6H2O、Ni（NO3）2·6H2O、Co（NO3）2·6H2O、AgNO3、Al（NO3）3·9H2O、Cr（NO3）3·9H2O、Hg（NO3）2·H2O购于上海阿拉丁试剂有限公司，除锌标准溶液外均为分析纯。测试所用溶剂为色谱纯。汞质控样购于环境保护部标准样品研究所。其余原料均从供应商处购买后直接使用。

1.2 金属离子浓度标定

用EDTA 待测溶液滴定锌标准溶液（二甲酚橙为指示剂，六次甲基四胺为缓冲溶液）至溶液由紫红色变为黄色即为滴定终点，平行滴定5 次，计算EDTA 溶液浓度。接着分别称量约2.0 g 各金属硝酸盐于100 mL 烧杯中，用去离子水溶解后转移至500 mL 容量瓶并定容；在pH 5.0～6.0 条件下，以二甲酚橙为指示剂，用已标定的EDTA滴定金属离子至紫色变为黄色即为滴定终点，平行滴定5次，计算金属离子溶液浓度。

1.3 探针合成

化合物1、2、3以及寡聚芳酰胺三聚体4按照参考文献［31，35］的方法进行合成。

在250 mL 三颈瓶中，加入4.46 g 寡聚芳酰胺三聚体4、1.42 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、760 mg 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT）和100 mL 二氯甲烷，常温下搅拌1 h 后，加入726 mg 3-氨基香豆素（化合物5），室温下过夜搅拌。待反应完全后，依次用稀盐酸和水洗涤产物，再以无水硫酸钠干燥后经硅胶柱层析（CH2Cl2-CH3OH，15∶1，体积比） 提纯，得橙色产物3.47 g，产率69.5%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.58（s，2H），9.47（s，2H），9.18（s，2H），9.02（s，1H），8.45（s，2H），7.65（d，J＝8.0 MHz，2H），7.65（t，J=8.0 Hz，2H），7.58（t，J=8.0 Hz，2H），7.52（d，J＝8.0 MHz，2H），6.55（s，3H），4.09（t，J=6.40 Hz，8H），3.80（s，12H），1.94（m，8H），1.17～1.44（m，72H），0.78～1.82（m，12H）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：164.87，163.82，159.30，158.50，156.57，151.47，149.26，145.33，143.05，136.87，130.23，128.32，125.90，121.81， 119.83， 117.25， 115.02， 112.84， 107.07， 107.52， 96.69， 94.89， 69.25， 61.84，31.91，29.71，29.69，29.67，29.59，29.36，26.02，22.67，14.07。ESI-HRMS：m/z1487.95［M＋H］＋。

1.4 光谱测试

分别取已标定的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Ag+、Cr3+、Al3+、Co2+、Hg2+金属离子溶液，用甲醇配制成1.0×10-3mol/L的金属离子贮备液。用CH2Cl2∶CH3OH=9∶1（体积比）混合液配制浓度为1.0×10-5mol/L的探针溶液。

取2.5 mL探针溶液至石英比色皿（厚度1.0 cm，体积3.0 mL）中，加入金属离子贮备液，最大加入量不超过0.1 mL，以减少体积变化对待测溶液浓度的影响［38］。轻微振摇后进行荧光光谱测试。本实验中，激发和发射波长分别为365 nm和515 nm，激发和发射狭缝宽度均为10 nm。

2 结果与讨论

2.1 探针对金属离子的识别

在配制的探针混合溶液中，分别加入1.0×10-5mol/L的K+、Na+、Ag+、Al3+、Co2+、Cr3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Hg2+金属离子溶液。结果如图2 所示，前15 种金属离子加入后体系荧光强度均较低，表明探针分子对这些金属离子没有响应或微弱响应；加入Hg2+后，515 nm 处出现一个很强的荧光发射峰，表明荧光探针对Hg2+具有很好的选择性。尽管加入Fe3+时探针分子具有一定荧光强度，但强度仅为Hg2+的五分之一，其影响可忽略。

图2 不同金属离子（1.0×10-5 mol/L）存在下探针COA（1.0×10-5 mol/L）的荧光发射光谱Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe COA（1.0×10-5 mol/L） in the presence of different metal ions（1.0×10-5 mol/L）

2.2 Hg2+浓度对荧光强度影响

考察了Hg2+浓度对探针COA 荧光强度的影响。在配制的探针混合溶液中，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5（×10-5mol/L）的Hg2+溶液，结果如图3 所示。随着Hg2+浓度的不断增加，COA 的荧光强度逐渐增强，当Hg2+浓度为1.5×10-5mol/L时，荧光强度增加了约15倍。Hg2+浓度达1.0×10-5mol/L后，探针COA的荧光强度几乎不再增加，荧光强度接近最大值，可推断探针COA与Hg2+的配比为1∶1。

图3 探针COA（1.0×10-5 mol/L）在不同Hg2+浓度下的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of probe COA（1.0×10-5 mol/L）with different concentrations of Hg2+

向已配制的探针溶液中，逐次加入0.1×10-5～1.0×10-5mol/L 的Hg2+，分别测定加入后的荧光强度，并利用Origin 8.0 软件拟合曲线。结果表明，Hg2+浓度（x）在0.1×10-5～1.0×10-5mol/L 范围内，与探针COA 的荧光强度（y）呈线性关系，线性方程为y=421.5818x+30.8454，相关系数（r2）为0.9953。根据3σ/k计算检出限（LOD），其中σ表示经10 次测量的探针空白溶液荧光强度的标准偏差，k为拟合曲线的斜率。经计算得到LOD 值为2.08×10-7mol/L，低于世界卫生组织对饮用水中Hg2+含量最低标准（4.98×10-7mol/L 即1.0×10-3mg/L）和我国《地表水环境质量标准》（GB 3838-2002）Ⅲ类水中Hg2+的标准限值（4.98×10-7mol/L）［14］，说明该COA 探针具有较强的检测能力。

2.3 共存金属离子的影响

为考察在其它金属离子共存下，探针COA选择性识别Hg2+的能力，进行了共存金属离子竞争实验。在探针溶液中加入1.0×10-5mol/L 的共存金属离子，测定其最大荧光强度，然后加入1.0×10-5mol/L 的Hg2+，比较加入Hg2+前后的最大荧光强度值。结果如图4 所示，加入Hg2+后，探针COA 与Ag+、Cr3+、Al3+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Ca2+、Mg2+、K+、Na+体系的荧光强度分别增加了23.7、 10.7、 9.9、 6.8、 10.0、 9.6、 6.2、10.8、15.3、9.1、14.4、28.5、18.4、29.6和51.9 倍。由此可知，Hg2+较其它金属离子具有更强的竞争力，探针COA 在选择性识别Hg2+时，不受其它共存金属离子的影响，具有很强的抗干扰能力。

图4 共存金属离子竞争实验Fig.4 Competition experiments of coexisting metal ions cHg2+=cmetal ions =1.0×10-5 mol/L

2.4 可逆性研究

为了考察探针COA 的回收情况和应用潜力，选用与Hg2+配位能力更强的EDTA（两者的稳定常数高达6.3×1021［39］）对其进行可逆性研究。结果如图5 所示，COA 探针的荧光强度很弱（曲线a），当加入Hg2+后，探针COA 与Hg2+相互作用，发出强烈的荧光（曲线b）；当加入EDTA 后，荧光强度回落到最初状态（曲线c），这是由于具有更强配位能力的EDTA 与Hg2+形成更稳定的配合物，从而释放出探针，说明探针COA在识别Hg2+的过程中具有可逆性。

图5 探针COA识别Hg2+的可逆实验Fig.5 Reversible experiment of probe COA to identify Hg2+

2.5 配位比的测定

本研究基于Job's plot 实验选用荧光光谱法确定探针与Hg2+的配位比。结果如图6 所示，随着［Hg2+］/（［COA］+［Hg2+］）的比值逐渐增大，荧光强度随之增强，当［Hg2+］/（［COA］+［Hg2+］）的比值为0.5时，荧光强度达到最高点，说明探针与Hg2+的配位比为1∶1，该结论与滴定实验结果一致。

图6 探针COA与Hg2+的Job's plot曲线Fig.6 Job's plot of probe COA and Hg2+

2.6 识别机理推测

由荧光滴定实验和Job's plot 实验可知，探针COA 与Hg2+的配位比为1∶1。为进一步确定探针COA 对Hg2+的识别机理，测定了COA、COA 和Hg2+络合物的红外光谱。结果如图7 所示，在COA的红外光谱中，1 690 cm-1处的峰归属为香豆素C=O 的振动峰［41］，1 660 cm-1处为寡聚芳酰胺C=O的伸缩振动峰［42］。当COA与Hg2+络合后，寡聚芳酰胺C=O 的伸缩振动峰红移至1 676 cm-1，而香豆素C=O 的振动峰仅红移至1 691 cm-1处。说明与Hg2+发生配位的是探针COA 中寡聚芳酰胺中的羰基氧，而非香豆素中的羰基氧。

图7 COA，COA和Hg2+络合物的红外光谱Fig.7 IR spectra of probe COA，COA and Hg2+ complex

采用核磁共振氢谱进一步推测了COA 对Hg2+的识别机理。结果如图8所示，加入Hg2+后，酰胺键质子Ha、Hb 和寡聚芳酰胺芳环质子Hc、Hd 分别向低场移动了0.38、0.31、0.52、0.57 ppm，而香豆素中的质子He 几乎没有发生位移，再次说明与Hg2+配位的是寡聚芳酰胺中的羰基氧，与红外光谱的结论一致。

图8 300 K下COA、COA和Hg2+络合物（2.0×10-3 mol/L）的核磁共振氢谱Fig.8 1H NMR spectra of COA，COA and Hg2+ complex（2.0×10-3 mol/L） at 300 K

结合以上分析，推测探针COA 和Hg2+的识别机理如图9所示。加入Hg2+前，在365 nm激发波长下，COA 探针中寡聚芳酰胺羰基氧上的孤对电子向荧光基团香豆素转移，发生光诱导电子转移（PET），使得探针COA 仅发出微弱的荧光；当探针COA 与Hg2+作用后，由于羰基氧上的孤对电子参与配位，无法发生PET 过程，从而使得探针在515 nm处发出很强的荧光。

图9 COA与Hg2+的识别机理Fig.9 Recognition mechanism of COA and Hg2+

2.7 探针对水样中Hg2+的检测

选取西河河水和实验室自来水为待测水样，分别进行1.0、5.0、10.0、15.0（×10-6mol/L）水平的加标实验，每个水平平行测定5次。结果如表1所示，水样中Hg2+的回收率为97.0%～104%，相对标准偏差（RSD）为1.5%～2.5%。汞质控样的检测结果在1倍偏差范围。

表1 实际水样中Hg2+的加标回收率和相对标准偏差Table 1 Recoveries and RSDs of Hg2+in different real water samples

为进一步拓展探针COA 的应用范围，检验其废水处理能力，本研究选取某城镇污水处理厂进出口排放的废水为样品，分别采用COA 探针和现行标准原子荧光法［40］进行测定，结果见表2。由表可知，探针COA 的检测结果与原子荧光法的检测结果基本一致，表明探针COA 适用于不同类型水样中Hg2+的定量检测，且具有很高的准确度和精密度。

表2 COA探针和原子荧光法对废水中Hg2+的检测结果对比Table 2 Comparison of determination results of Hg2+ by COA fluorescence probe and atomic fluorescence spectrometry

3 结 论

本文设计合成了一种新型的基于香豆素的寡聚芳酰胺类荧光探针COA，该探针可高效识别Hg2+，且具有较强的抗干扰性和较好的可逆性。COA 探针可与Hg2+形成1∶1 配合物，IR 和1H NMR 实验结果推测探针COA 荧光强度显著增强是PET 过程中断所致。该探针对Hg2+的检出限为2.08×10-7mol/L，满足世界卫生组织对饮用水的最低允许浓度要求，也低于我国《地表水环境质量标准》（GB 3838-2002）Ⅲ类水中Hg2+的标准限值。该探针适用于不同水样中Hg2+的定量检测，且准确度和精密度较高，满足水质检测相关要求。