不同酵母发酵的白兰地基酒在蒸馏前后的香气分析

马玥,吴元,张葆春,申春华,于立娜,巩传斌,李成林,唐柯*

1(江南大学 生物工程学院 酿造微生物与应用酶学研究室,江苏 无锡,214122)2(烟台张裕集团有限公司,山东 烟台,264000)

白兰地是世界著名的蒸馏酒之一,与威士忌、金酒、伏特加、朗姆酒以及中国的白酒共称为世界六大蒸馏酒[1]。白兰地起源于法国的夏朗德地区,早在19世纪90年代传播到中国。白兰地的成分非常复杂,其中水和乙醇占总成分98%以上,构成白兰地最主要的成分,但不足1%的挥发性化合物决定其香气品质[2],主要包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、酚类、芳香化合物、萜类、内酯类等多种化合物,其中异丁醇、反式-β-甲基-γ-辛内酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、异戊醇、辛酸乙酯、β-大马酮是关键呈香化合物[3]。尽管这些挥发性香气成分含量很低,但却是白兰地香味、口感及酒体等方面特征的主要来源,其种类、含量、感觉阈值决定着白兰地的风味和典型性[2]。在过去的几十年里,随着白兰地在中国越来越受欢迎,其特色和独特的风味开始受到消费者的更多关注。

白兰地中的化合物的差异主要来自于葡萄原料、酿造和蒸馏工艺及橡木桶陈酿[4-5]。通常白兰地以葡萄为原料,先经过葡萄取汁、自然发酵或加酵母发酵等过程获得酒精度较低的白兰地原料葡萄酒后,再经过二次蒸馏得到新蒸馏的原白兰地,最后经过橡木桶长时间的陈酿获得高档成品白兰地。在发酵过程中,酵母株的选择对于酿造特定风味的酒至关重要,不同的酵母在从葡萄前体释放品种挥发性化合物方面及在合成新的酵母衍生挥发性化合物方面能力不同[6],从而影响这些挥发性化合物的最终水平,造成白兰地的品质差异。ZHAO等[7]研究了8株商用酿酒酵母对白兰地的影响,结果表明由于使用不同酵母,白兰地出现了不同风味。姜忠军[8]对不同酿酒酵母在发酵过程中对有机酸、pH、香气成分影响进行分析,得出不同酵母对白兰地香气和感官有不同影响。程显好等[9]也比较分析了不同酵母对白兰地风味的影响。

这些研究为白兰地酿造者选择发酵酵母提供了有用信息。而在蒸馏过程中,大部分的水会被冷凝去除,原料和发酵中的挥发性成分浓缩,此外还会有新的化合物产生,这一过程使得白兰地香气较大多葡萄酒更为浓郁、复杂[10]。AWAD等[11]对干邑白兰地在蒸馏过程中的挥发性化合物变化情况进行研究分析,结果发现在一次蒸馏过程中得到的挥发性化合物对白兰地的香气特征起着决定性作用。TSAKIRIS等[12]研究了白兰地在蒸馏过程中化合物的变化,结果显示醇类和芳香物质含量明显增多。宋普等[13]研究白兰地中主要的芳香类化合物在蒸馏过程中的变化规律,结果显示苯甲醛、乙酸苯乙酯和苯乙醇的含量在酒身时开始馏出,在次酒尾时含量较高,在酒头和酒尾中含量较低。这些研究为白兰地工艺的优化、产品品质的进一步提高提供基础数据及理论依据。

虽然上述研究者已经对不同酵母发酵的白兰地基酒中的挥发性化合物进行了研究,但是由于一维气相色谱分析的共留出等限制,部分香气化合物并未检出。本研究基于以上内容,通过全二维气相色谱-飞行时间质谱对样品进行分析,以实现更全面的白兰地香气化合物的检测,同时结合感官定量描述分析,探究了以不同酵母(71B、KD、F33、K1、FC9DP、D254、FC9)酿造的新疆产区的白兰地发酵酒及其新蒸馏原白兰地在挥发性风味物质及香气特征的差异,从而为白兰地酿造工艺的进一步改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验样品

实验酒样由烟台张裕集团有限公司提供。

样品的生产工艺如下:原料采用2021年新疆产区白玉霓酿酒葡萄,含糖量162 g/L(发酵后酒精体积分数为8.3%～8.8%),随后采用夏朗德壶式蒸馏器进行二次蒸馏,获得白兰地原酒,实验分析中所有二次蒸馏后的白兰地原酒酒精体积分数为68%。

1.1.2 试剂

正构烷烃(C5～C30,色谱纯),美国Sigma公司;NaCl(分析纯),中国国药上海化学试剂公司;乙酸苯乙酯同位素(纯度>95%),美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

DVB/CAR/PDMS固相微萃取三相头(2 cm 50/30 μm),美国默克公司;Agilent 7890 N-Pegasus 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱,美国安捷伦、LECO公司;DB-FFAP毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国安捷伦公司;Rxi-17Sil MS色谱柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美国瑞思泰康(Restek)公司;多功能自动进样系统(MPS),德国Geststel公司;SB-25-12D超声波清洗仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;Milli-Q 纯水仪,美国Millipore公司;电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 香气萃取方法

样品香气萃取由MPS2系统进行顶空固相微萃取(headspace solid phase micro extraction, HS-SPME)自动进样分析。蒸馏酒稀释10倍后进行香气分析。所有酒样取5 mL置于20 mL顶空瓶中,加入1.5 g NaCl及10 μL乙酸苯乙酯同位素(浓度为204 mg/L)作为内标。萃取温度50 ℃,样品平衡5 min,萃取45 min,转速400 r/min。萃取结束后,将萃取头置于气相色谱(gas chromatography,GC)进样口,在250 ℃下解吸附5 min,不分流进样,每个样品重复3次。

1.3.2 全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography and time of flight mass spectrometer,GC×GC-TOFMS)分析

全二维气相色谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography,GC×GC)条件:起始温度45 ℃保持3 min后,以4 ℃/min升温至150 ℃并保持2 min,之后以6 ℃/min升温至200 ℃,然后以10 ℃/min升温至230 ℃并保持10 min。

飞行时间质谱(time of flight mass spectrometer,TOFMS)条件:离子源电压70 eV,温度230 ℃,传输线温度240 ℃,检测器电压1 430 V,采集质量数范围为35～400 amu,采集频率100 spectra/s。

1.3.3 香气化合物定性及定量分析

样品中挥发性化合物的定性:通过LECO公司自带ChromaTOF®工作站(version 4.44)处理数据。用于峰值拾取的分段信噪比(S/N)设置为200∶1,至少2个顶点质量。在单个色谱图中,当二维子峰的谱图相似度至少满足匹配度为800且S/N≥6时可被合并为同一个峰。运用软件的数据比较功能自动匹配相似度≥800且3个平行样品中至少出现2次的峰作为该酒样中存在的组分。峰的Kovats保留指数(retention index,RI)通过在相同色谱条件下用正构烷烃(C5～C30)校准获得。经过文献比对,筛选RI相差10以内的化合物作为最终的定性结果。与标准品色谱峰比对:对通过RI对比进一步鉴定出的化合物用标准品进行色谱峰比对,进一步验证定性结果。挥发性化合物的半定量计算如公式(1)所示:

(1)

1.3.4 感官分析

本研究从江南大学选取12名(18～30岁,5男7女)人员组成健康评价员小组,这些评价员按照国际标准(ISO 5496:2006)招募及培训,且通过香气识别相关的考核与香气标度方面的测试。参考之前课题组对白兰地酒研究中的感官分析结果,结合小组成员讨论,最终选择13个能够全面描述所有待测白兰地酒样品的特征性和差异性的香气描述词,如表1所示。在正式实验前,基于13个香气属性对感官小组及其评价员进行评估,采用Panel check软件[14]分析结果,结果显示12名评价员在一致性、稳定性及区分能力上表现较好,可进行白兰地酒样品正式的香气描述分析。

表1 白兰地香气的描述词及其描述词的参照物Table 1 Descriptors of brandy aroma and their references

在正式实验时,将不同的白兰地酒样(10 mL)分别倒入3位随机数字编码的ISO标准品评杯中,样品顺序采用随机完全区组设计,依次递送给每个评价员。要求评价员在独立的品评隔间里(25 ℃)对样品进行品评。每个样品品评时间间隔1 min,3个样品为一轮,每轮样品间休息10 min,以避免嗅觉疲劳。定量描述性分析采用7点标度法,其中0表示无法感知属性强度,6表示属性具有最高强度[15]。

1.3.5 数据处理

香气化合物数据及感官数据通过Excel 2019进行处理;热图分析采用R语言(版本4.0.1)中的ComplexHeatmap数据包中的Heatmap功能来实现。主成分分析(principal component analysis,PCA)采用SIMCA 2016进行;偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)使用XLSTAT 2019进行。

2 结果与分析

2.1 不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒的香气比较

2.1.1 香气化合物分析

在所有样品中共定性检出485种挥发性化合物,结合香气物质数据库Flavornet(http://www.flavornet.org/flavornet.html)进行匹配,筛选出174种在酒精饮料中具有主要香气特征化合物进一步分析。将定性后的化合物分为醇类、芳香族、酚类、呋喃类、含氮化合物、含硫化合物、内酯类、醛类、酸类、萜烯类、酮类、酯类及其他共计13类。

比较经不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒中香气种类的差异,结果显示(图1),经D254酵母发酵的酒样化合物数量较多,为102种,而经KD酵母发酵的酒样化合物数量较少,为86种。

图1 不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒的香气化合物对比Fig.1 Comparison of aroma compounds in raw brandy wines after fermentation with different yeasts

对定性到的化合物进行半定量分析,结果见电子增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038013)。比较不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒中不同类别的香气化合物相对含量的差异,结果显示(表2),经不同酵母发酵的发酵酒中,芳香族化合物仅在71B、FC9DP及KD发酵酒中检出。而其他类别的化合物含量,醇类最高的为KD,最低的为FC9DP;酚类最高的为D254,最低的为K1酵母;呋喃类最高的为FC9,最低的为K1,含硫化合物最高的为KD,最低的为D254;内酯类最高的为KD,最低的为71B;醛类最高的为FC9DP,最低的为K1;酸类最高的为KD,最低的为K1;萜烯类最高的为FC9DP,最低的为KD;酮类最高的为FC9,最低的为K1;酯类最高的为D254酵母,最低的为FC9DP。

表2 不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒香气化合物的半定量含量 单位:μg/LTable 2 Semi-quantitative content of aroma compounds in raw brandy wines after fermentation with different yeasts

将这些不同酵母发酵的样品中具有显著差异的香气化合物,根据半定量含量绘制聚类热图,结果如图2所示。聚类分析根据化合物含量高低将相似的组别聚在一起。分为三大类,其中FC9DP为一类,D254和FC9聚为一类,F33、71B、K1及KD聚为一类。结果可知,添加酵母FC9DP的酒样的大马士酮、乙酸苯乙酯、异戊醇、柠檬烯等化合物的含量相对其他样品较高;添加酵母D254和FC9的酒样相比其他样品,其酯类化合物含量较高,其中FC9酒样的二甲基二硫及二甲基三硫2种含硫化合物在所有样品中含量最高,而添加酵母D254的酒样的1-戊醇、反式-2-辛烯-1-醇、反式-2-己烯酸等化合物在所有样品中含量最高;添加酵母KD的酒样的月桂酸甲酯、金合欢烯、2,3-丁二醇等化合物的含量相对其他样品较高;添加71B的酒样的苯乙酮、γ-辛内酯、β-环柠檬醛、癸醛、乙酸丁酯等化合物的含量相对其他样品较高;添加K1的样品乙酸香叶酯、乙酸香茅酯、十二醛、4-甲基-2-戊醇及4-乙烯基愈创木酚等化合物的含量相对其他样品较高;添加F33酒样的异松油烯、2,3-二甲基-3-戊醇、庚醇的含量相对其他样品较高。

图2 不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒香气化合物含量的热图Fig.2 Heat map of the content of aroma compounds in raw brandy wine after fermentation with different yeasts

2.1.2 感官分析

采用了定量描述分析比较不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒香气在感官上的差异并对整理后的数据做香气轮廓图,结果如图3所示。结果显示添加不同酵母发酵后的白兰地葡萄酒基酒香气轮廓差异较小,所有样品都具有明显的酵母、酸味、生青及较明显的花香、果香、香料、果干香气,而在尾气、木质、焦糖、烘烤、皮革等香气属性上强度较低。

图3 不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒香气轮廓图Fig.3 Aroma profiles of raw brandy wines after different yeast fermentation

为更方便得出添加不同酵母酒样间所具有的香气属性的差异,对样品的感官分析结果进行PCA,结果如图4所示,前2个主成分共包含了61.5%的变量信息,结果显示添加酵母K1及FC9的酒样在第1主成分负方向,与酵母、酸味属性相关;添加D254的酒样在第1主成分正向,与果香、花香属性相关,FC9DP在第2主成分负方向,与生青、皮革、香料、焦糖、烘烤等属性相关;其余酒样集中在中心区域,与木质属性更相关。

图4 不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒香气的PCAFig.4 PCA of the aroma in raw brandy wine after fermentation with different yeasts

2.2 白兰地葡萄酒基酒蒸馏后的香气比较

2.2.1 香气化合物分析

比较不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒蒸馏后的香气种类的差异,如图5所示,结果显示重要香气化合物检测数量最高的酒样所添加的酵母种类为FC9DP,共定性出的关键香气化合物为107种;而添F33酵母的蒸馏后的酒样化合物数量较少,为99种。

图5 发酵后的白兰地葡萄酒基酒在蒸馏后的香气化合物对比Fig.5 Comparison of aroma compounds of raw brandy wines after fermentation and distillation

对定性到的化合物进行半定量分析,半定量结果见电子增强出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038013)。比较不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒蒸馏后的香气化合物相对含量的差异,如表3所示,结果显示添加酵母FC9DP的化合物半定量总量最高,K1的酒样半定量含量最低。醇类最高的为FC9DP,最低的为D254;芳香族最高的为71B,最低的为KD;酚类最高的为FC9DP,最低的为F33;呋喃类最高的为KD,最低的为K1;有3个样品在蒸馏后检测出含氮类香气化合物;含硫化合物最高的为KD,最低的为K1;内酯类最高的为FC9,最低的为FC9DP;醛类最高的为KD,最低的为FC9DP;酸类最高的为FC9DP,最低的为FC9;萜烯类最高的为FC9DP,最低的为D254;酮类最高的为KD,最低的为D254;酯类最高的为FC9DP酵母,最低的为K1。

表3 发酵后的白兰地葡萄酒基酒经蒸馏后的香气化合物的半定量含量 单位:μg/LTable 3 Semi-quantitative content of aroma compounds in raw brandy wines after fermentation and distillation

将蒸馏后检测出的这些不同酵母发酵的样品中具有显著性差异的香气化合物(电子增强出版附表2)根据半定量含量绘制聚类热图,结果如图6所示。

图6 发酵后的白兰地葡萄酒基酒在蒸馏后的香气化合物含量的热图Fig.6 Heat map of the content of aroma compounds in raw brandy wine after fermentation and distillation

聚类分析结果可以看出图中有3类:添加酵母FC9DP为一类,添加酵母71B及KD为一类,其余酒样为一类。其中添加酵母FC9DP的样品在蒸馏后相较其他样品,除了(E)-β-罗勒烯、2,3-丁二酮、2-戊醇、苯甲醛、异松油烯等之外的其他的香气化合物含量都较高,添加酵母71B和KD的酒样在蒸馏后相较其他样品,各类化合物的相对含量相对较平衡,但酵母KD酒样的苯乙烯、乙酸及乙酸丁酯含量较低。结果显示,F33、K1、D254及FC9样品为一类,这些样品在蒸馏后大部分的化合物的相对含量相比FC9DP、71B及KD皆较低,但是FC9的十四酸乙酯、己酸己酯、乙酸香茅酯、3-戊醇、2-羟基苯甲酸乙酯及D254的己醛、乙酸异戊酯、柠檬醛在蒸馏后相较其他样品较高。

2.2.2 感官分析

采用了定量描述分析比较经不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒蒸馏后香气在感官上的差异并对整理后的数据做香气轮廓图,结果如图7所示。结果显示所有蒸馏酒样都有强烈的乙醇、果香和较强的果干、花香气味及微弱的生青与酸气味。而添加不同酵母的蒸馏酒样香气特征的区别集中在焦糖、香料、烘烤香上,其中添加酵母FC9的酒样在蒸馏后在焦糖、香料及烘烤香气属性皆最强,其次是添加FC9DP和KD的酒样,较弱的是添加K1、F33、D254及71B的酒样。

图7 发酵后的白兰地葡萄酒基酒在蒸馏后的香气轮廓图Fig.7 Aroma profiles of raw brandy wines after different yeast fermentations and distillation

为更方便看出经不同酵母发酵再蒸馏后的酒样间所具有的香气属性差异,对样品的感官分析结果进行PCA,结果如图8所示,前2个主成分共包含了72.0%的变量信息,结果显示添加酵母FC9与FC9DP的酒样在第1主成分负向,主要与花香、果香、烘烤、果干、香料等属性相关,且其香气属性相对成熟丰富;添加酵母K1分布在第1主成分正向,与尾气、酵母属性相关。

图8 发酵后的白兰地葡萄酒基酒在蒸馏后的香气的PCAFig.8 PCA of the aroma in raw brandy wine after fermentation and distillation

2.3 白兰地葡萄酒基酒蒸馏前后的香气比较

2.3.1 香气化合物分析

比较蒸馏前(图1)及蒸馏后(图5)检测到的各类香气化合物的数量差异,结果显示蒸馏后检测到的化合物总数量增加,但是检测到的酯类化合物、内酯类化合物、酚类化合物及醇类化合物的种类皆减少,而检测到的芳香族、呋喃类、酮类、萜烯类、含氮及含硫类化合物的种类增加。比较蒸馏前(表2)及蒸馏后(表3)检测到的各类香气化合物的相对含量差异,结果显示由于蒸馏作用,除了酚类化合物及内酯类化合物,大部分香气化合物的相对含量皆增加,其中酯类、醇类、酸类及萜烯类化合物增加最明显的皆为FC9DP样品。

将检测出的这些不同酵母发酵的样品中在蒸馏前后具有显著性差异的香气化合物根据半定量含量绘制聚类热图,结果如图9所示。结果显示蒸馏前后的样品根据香气化合物相对含量的分布情况可分成2类,其中所有蒸馏前的样品聚为一类,大部分的蒸馏后的样品聚为一类,但是蒸馏后的D254样品在香气化合物相对含量的分布情况更接近于蒸馏前的样品。

图9 发酵后的白兰地葡萄酒基酒在蒸馏前后的香气化合物含量的热图Fig.9 Heat map of the content of aroma compounds in raw brandy wine before and after distillation

2.3.2 感官分析

通过PLS-DA对定量描述分析获得的经不同酵母发酵后白兰地葡萄酒基酒在蒸馏前后的香气的感官差异,结果如图10所示,蒸馏前的香气属性大都集中在生青、酵母、酸味、皮革、尾气上,而蒸馏酒香气属性则集中在乙醇、果香、果干、花香、焦糖、烘烤、香料上,结果显示经过蒸馏以后,基酒香气得到了明显的改善,去除了生青、酸味这些不良的香气特征,蒸馏酒的香气更加芳香馥郁。

图10 发酵后的白兰地葡萄酒基酒在蒸馏前后的香气的PLS-DAFig.10 PLS-DA of the aroma in raw brandy wine before and after distillation

3 结论与讨论

在前期研究中程显好等[9]比较了不同酵母菌对白兰地35种挥发性成分的影响,结果显示酵母菌株对发酵产物影响很大,尤其是对酯类成分和杂醇油成分。因此选取最适宜的酵母是保证产品风味质量的关键因素之一。本研究通过全二维气相色谱-飞行时间质谱分析结合感官定量描述分析,探究了以不同酵母(71B、KD、F33、K1、FC9DP、D254、FC9)酿造的新疆产区的白兰地发酵酒及其新蒸馏原白兰地关于174种重要香气化合物及样品整体香气特征的差异。结果显示,不同酵母菌发酵的样品检出的不同类别香气化合物有较大差异,添加D254酵母的发酵酒样可检出102种香气化合物,而添加KD酵母的发酵酒样可检测的化合物数量仅为86种。此外添加不同酵母发酵的基酒中,D254的发酵基酒的香气物质总含量最高,该样品的果香、花香、木质属性也更突出,结果显示D254的发酵基酒中,己醛、乙酸异戊酯、柠檬醛等具有植物香及果香的香气化合物在蒸馏后相较其他样品较高。

在前期研究中AWAD等[11]对干邑白兰地在蒸馏过程中的挥发性化合物变化情况进行研究分析,结果在一次蒸馏过程中发现得到的挥发性化合物对白兰地的香气特征起着决定性的作用,此外,在这一过程中还生成了新的酯类、醛类、降异戊烯类和萜类化合物及其他由于高温引起的化学反应而形成的化合物。本研究结果显示,蒸馏后的样品检出的不同类别香气化合物的种类增加,其中重要香气化合物检测数量最高的酒样所添加的酵母种类为FC9DP,共定性出的关键香气化合物为107种;而添加F33酵母的蒸馏后的酒样化合物数量较少,为99种,其中大部分样品在蒸馏后检出的芳香族、呋喃类、含氮化合物、含硫化合物、醛类、萜烯类及酮类化合物的种类皆增加。这也验证了AWAD等[11]关于蒸馏作用由于高温引起的化学反应会形成的新化合物的结论。在蒸馏后,添加酵母FC9DP酒样的香气化合物相对含量最高,且FC9DP酒样与FC9的酒样香气属性更为丰富,其中花香、果香、木质属性突出。经过蒸馏以后,除了酚类及内酯类化合物,大部分香气化合物的相对含量皆增加,其中酯类、醇类、酸类及萜烯类化合物增加最明显的皆为FC9DP样品。此外,发酵基酒香气得到了明显的改善,去除了生青、酸味这些不良的香气特征,蒸馏酒的香气也更加芳香馥郁。本研究可为白兰地酿造工艺的进一步改进提供数据参考。