基于网络药理学探究苦苣菜治疗急性肝损伤的作用机制

梁薛峰，孙锦怡，王成，曹彬，倪子薇，段伟，阮彩莲

1延安大学医学院，延安 716000；2延安大学附属医院肿瘤科，延安 716000

苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）又名苦菜、滇苦菜、苦荬菜等等，是一种药食同源类中草药，属菊科苦苣菜属，为一年生或二年生草本植物[1]。其主要活性成分是倍半萜类、黄酮类和酚类化合物等，分别具有抗炎、抗氧化、抗癌、降压、改善心脑血管疾病、降血脂、降胆固醇、保肝护肝等多种药理或保健作用[2-4]。早在《嘉祐本草》中就有记载，苦苣用于清热解毒，主治黄疸、胃炎、痢疾、肺热咳嗽等疾病，具有保肝护肝的功效。并且苦苣菜有分布广泛、易于存活、容易获取等优点，这也为其具有较高的药用价值奠定了基础[5]。肝脏是人体重要的代谢器官，该器官的损伤会对人体代谢、排毒等功能造成严重影响，进一步发展将会引发病毒性肝炎、肝纤维化甚至肝癌等疾病，故每年肝损伤患者死亡率很高[6]。肝脏损伤是指由病毒、药物、酒精、缺氧等因素导致的，与氧化应激、炎症反应等机制密切相关的肝脏组织病理改变，全球每年有200 万人死于肝脏疾病，其中100 万人死于肝硬化并发症，100 万人死于病毒性肝炎和肝癌，肝脏疾病对人类健康的影响巨大[7]。网络药理学作为一种基于系统生物学理论以对生物系统多层次分析的交叉新兴学科，通过创建多靶点与多疾病间复杂网状关系，对复杂疾病发病及治疗具有潜在应用价值，近年来已成为中医药学研究中常用的虚拟筛选方法之一，为中药的治疗、应用提供了研究方向[8]。已有研究表明，苦苣菜水醇提取物对小鼠具有明确的抗炎、抗氧化等功效，但其具体作用机制目前并不清楚[3]。并且目前中药方面对苦苣菜的药理作用研究较为广泛，但对疾病的作用机制研究尚有欠缺，这导致临床中缺乏与中药成分相关的保肝护肝类药物[9]。故本研究通过基于网络药理学的研究方法，对中药苦苣菜的天然活性成分及其对人类的关键作用靶点进行筛选，并将之与急性肝损伤（acute liver injury，ALI）疾病基因进行对接去重，再对其潜在作用靶标进行蛋白互作网络构建，所富集的生物过程、通路进行系统分析及可视化，以阐述苦苣菜对ALI 的药理作用机制，为进一步深入研究苦苣菜对ALI 的治疗作用机制奠定了研究基础，对临床上治疗肝损伤新药研发领域具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件 本研究数据来源于以下数据库与软件。见表1。

表1 数据库与软件

1.2 苦苣菜活性成分的获取与筛选 通过在中药系统药理学分析平台TCMSP 中检索“苦苣菜”“苦菜”“山苦荬”“Sonchus oleraceus L.”得到苦苣菜的化学成分。发现苦苣菜及相关名称没有收录在TCMSP 中，在HERB 本草组鉴查询苦菜的有效成分也未查询到相关结果。根据超高效液相色谱-质谱数据，将苦苣菜活性单体成分输入TCMSP 之中，并筛选口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 的活性单体成分（OB 值意味着该成分可以被人体吸收利用的程度，DL 值意味着该成分可以被用作药物的可能性大小），获得苦苣菜有效活性成分。

1.3 苦苣菜活性成分潜在靶点获取及成分-靶点网络图的构建 在Pubchem 中获取苦苣菜活性成分的SMILES 号，并将其输入至Swiss Target Prediction 基因库中进行靶基因预测，选取HOMO SAPIENS 人类基因库进行检索，将得到的各种活性成分对应的靶基因导出，并删除无对应基因名的靶点，筛选靶基因可信度（P ≥0.01）或者目标可信度等级排名前15 个的靶点并进行合并去重，借助使用Uniprot 将所有靶点基因全称转变为简称，将其与苦苣菜活性有效成分相关联，使用Cytoscape 3.9.1 构建出苦苣菜活性成分-靶点网络图。

1.4 急性肝损伤靶点获取 使用OMIM 及GeneCards基因库获取疾病目的基因，以“acute liver injury”为关键词进行搜索，获取急性肝损伤疾病靶点，按相关性分数由高到低排序，以分值＞2 倍中位数为筛选条件筛选疾病靶点，所得结果合并之后去除重复靶点，将其作为急性肝损伤的疾病靶点信息。

1.5 苦苣菜活性成分与急性肝损伤交集靶点的获取 将得到的苦苣菜活性成分潜在靶点和急性肝损伤疾病靶点共同导入微生信平台的Venn 图绘制工具，两者取交集并导出交集靶点，获取中药活性成分与疾病的交集靶点，即视为苦苣菜治疗急性肝损伤的潜在作用靶点。

1.6 苦苣菜治疗急性肝损伤核心靶点的筛选及PPI 网络图构建 将获得的苦苣菜-急性肝损伤的潜在共同靶点输入STRING 进行PPI 蛋白互作分析，导出原图及数据，利用Cytoscape 3.9.1 软件构建PPI 网络图，计算参数阈值，通过筛选BC（betweenness centrality，介数中心性度）、Degree（DC，结点中心度）、CC（closeness centrality，紧密中心度）值，筛选出关键靶点，将其视为苦苣菜治疗急性肝损伤发挥药效的关键靶点。

1.7 苦苣菜治疗急性肝损伤的GO 及KEGG 富集分析 将中药成分-疾病交集靶点导入DAVID 2022[10]，进行基因本体（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，选择生物过程（biological process，BP）、细胞组 成（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）三个条目，设定分析物种为“HOMO SAPIENS”，设置P ＜0.01，GO 富集分析选择排名前10 条的BP、CC、MF 条目和KEGG 富集分析排名前20 条条目，最后利用微生信进行GO 富集柱状图及KEGG 富集气泡图的制作。

1.8 KEGG 通路可视化处理 在从DAVID 导出KEGG 通路富集分析数据后，利用微生信平台对通路进行初步可视化分析，选择相对重要的一条通路图，再使用Adobe Illustrator 2022，对其进行进一步可视化处理，更加直观。

2 结果

2.1 苦苣菜活性成分的获取与筛选 根据超高效液相色谱-质谱数据，获得苦苣菜成分共304 种，将其输入TCMSP 中，最终筛选出芦荟大黄素等21 种有效活性成分并进行列表。见表2。

表2 苦苣菜有效成分信息表

2.2 苦苣菜活性成分潜在靶点筛选及成分-靶点网络图的构建 将21 种苦苣菜有效活性成分输入Swiss Target Prediction 基因库中，得到潜在靶点共314 个，去重后得到潜在靶点共174 个，并使用Uniprot 将所有基因转变为简称，将其与苦苣菜活性成分相关联，Cytoscape 3.9.1 构建苦苣菜活性成分-靶点网络图。见图1。

图1 苦苣菜活性成分-靶点网络图

2.3 急性肝损伤靶点获取及苦苣菜-急性肝损伤共同靶点获取 在OMIM、Genecards 基因库中共获取8868 个急性肝损伤靶点，按条件筛选后，所得结果合并、去重得到2842 个肝损伤靶点。将苦苣菜活性成分靶点与急性肝损伤靶点共同导入微生信平台，两者取交集导出85 个交集靶点，作为苦苣菜-急性肝损伤共同靶点，导出Venn 图。见图2。

图2 苦苣菜-急性肝损伤共同靶点venn图

2.4 苦苣菜治疗急性肝损伤关键靶点的筛选及蛋白互作网络图的构建 将苦苣菜-急性肝损伤共同靶点输入STRING 获得PPI 蛋白互作关系、BC、Degree（DC）、CC 值，Cytoscape 3.9.1 软件构建PPI 网络，筛选BC ＞24、Degree ＞30、CC ＞0.5，共筛选出22 个关键靶点。见图3。排名前3 的分别为TNF、TP53、PPARG，预测22 个关键蛋白在急性肝损伤的发病中起到关键的作用，同时也是苦苣菜发挥药效的作用位点。

图3 苦苣菜治疗急性肝损伤PPI网络

2.5 靶基因的GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 向DAVID 导入苦苣菜-急性肝损伤交集靶点后导出数据，获得GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析结果如下，GO 功能富集分析选择排名前10 条的BP、CC、MF 条目，KEGG 通路富集分析排名前20 条条目，利用微生信制作GO 富集柱状图及KEGG 富集气泡图导出。

GO-BP 分析显示有338 条生物学过程与此有关，分别为：对外源性刺激的反应、凋亡过程正向调控、MAPK 级联反应正向调控等。GO-CC 分析显示有51 条细胞组成与此有关，分别为：受体复合物、膜筏、细胞溶质等。GO-MF 分析显示有103 条分子功能与此有关，分别为：酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。

KEGG 分析显示有131 条信号通路与此有关，富集最显著分别为：癌症信号通路、FcεRI 信号通路、IL-17 信号通路等。见图4、图5。

图4 苦苣菜-急性肝损伤交集靶点GO富集分析柱状图

图5 苦苣菜-急性肝损伤交集靶点KEGG富集分析气泡图

2.6 KEGG 富集信号通路可视化处理 将从DAVID获得的KEGG 通路富集分析数据导入微生信平台，获得所有通路的可视化分析图。P 值排名第1 的Pathways in cancer，已有张晴晴等众多学者[11-12]在其网络药理学研究中进行阐述或可视化分析，经查阅文献，最终选择排名第2 的Fc epsilon RI signaling pathway 进行可视化展示更有意义，并用Adobe Illustrator 2022 进一步展示模式图，以便查看。见图6。

图6 FcεRI-MAPK信号通路模式图

3 讨论

苦苣菜自古以来便是我国传统的药食同源类中草药，分类繁多，最常见的无花苦苣菜即全叶苦苣菜通常作为野菜所食用，早在《神农本草经》中便有记载，其性味苦寒，可治疗厌食、血淋和痔瘘，还有养胃、利小便等功能[13]。进入现代医学，随着中药具体成分被逐渐发掘以及中药网络药理学、系统生物学等方法的出现，苦苣菜更多的药效被学者所发现，进一步被用于治疗炎症、抗菌、降血糖、降血压、血脂、保肝护肝等药用方面[9]。网络药理学、生信分析的出现将中草药成分与现代疾病分子机制关联起来为中草药治疗现代疾病提供了探索依据[14]。

近年来，关于苦苣菜的药理作用相关研究越来越多，但大多都停留在药效层面，对其具体药效分子机制有待深入研究。随着临床药物的更多使用、饮酒习惯的伴随，且我国是肝炎病毒大国，药物性、酒精性、病毒性肝损伤的发病率逐年上升，临床目前急需相关药物[15]。而网络药理学的出现，为疾病的靶向治疗提供了可能，通过从苦苣菜的活性成分分析、GO、KEGG 富集分析、通路可视化展示等方式，预测苦苣菜对急性肝损伤的具体作用靶点及机制，将对药物的研发及疾病的治疗提供重要依据。

通过超高效液相色谱-质谱数据、TCMSP、HERB对苦苣菜活性成分进行查找、筛选，共找到芦荟大黄素、山柰酚等21 种有效活性成分，将其视为苦苣菜的主要活性成分。芦荟大黄素属蒽醌类化合物，谭章斌[16]等发现芦荟大黄素可以通过抑制肝癌细胞内Src/STAT3信号通路以及抑制下游相关蛋白的表达来抑制肝癌细胞的增殖，而Src/STAT3 信号通路在炎症反应及多种肿瘤细胞的增殖反应中起到关键作用，提示其可以抑制肝脏的炎症反应及肿瘤细胞的增殖。研究发现，芦荟大黄素还可通过阻断iNOS 和COX-2 mRNA 的表达来起到抑制炎症反应的作用[17]，起到抗炎作用。山柰酚，属黄酮类化合物，黄酮类化合物为苦苣菜主要活性成分之一，研究表明，山奈酚可以通过抑制CYP2E1 的表达及其活性起到保护肝脏，抵抗酒精性肝损伤的作用，而CYP2E1 是酒精在体内代谢的关键酶类，其活性的减低可以有效的减少酒精性肝损伤的损害[18]。综上，苦苣菜活性成分能够起到抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用，推测其为苦苣菜发挥药效的重要成分，为疾病的研究起到了重要的药用价值。

苦苣菜活性成分对人类的作用靶点众多，通过OMIM 及GeneCards 基因库获取疾病基因，并与苦菜活性成分靶点取交集得到85 个靶点，筛选最终得到苦苣菜治疗急性肝损伤关键靶点22 个，将其视为苦苣菜发挥药效的关键靶点，主要为TNF、TP53、PPARG、CASP3 等，其中较多靶点与细胞的炎症、凋亡、损伤、增殖、分化有着相似的生物学效应及协同效应。TNF 在肿瘤细胞的损伤、凋亡中起着关键作用，其可诱导肿瘤细胞凋亡、参与机体免疫应答、诱导细胞程序性死亡以及影响肿瘤血管功能等方面发挥作用，对乳腺癌、胃癌、肝癌起到重要的调控作用[19]。TP53为人体的抑癌基因。其突变往往预示着患癌风险，其可以通过促进肿瘤细胞的增殖、迁移、生存等，促进肿瘤的进展及恶变，胃癌、结肠癌、食管癌等都与TP53 的突变息息相关[20]。PPARG 属于类固醇激素受体，主要起到脂质分化调控的作用，在脂肪组织、血管平滑肌组织中广泛表达，研究显示，该基因的激活与缺血性脑卒中、冠心病的发病密切相关。肝脏脂质的堆积也会引起肝炎、肝硬化导致肝脏损伤[21]。当细胞受损时，CASP3 会起到促进细胞凋亡的作用，其缺失、突变会导致细胞凋亡中断，导致肿瘤的发生、恶化，与肝癌的发生存在关系[22]。综上，部分关键靶点在炎症反应、肿瘤细胞的发生、发展中起到了相似的作用，也预示苦苣菜的作用位点很有可能与其相关。

通过对苦苣菜活性成分-急性肝损伤交集靶点进行GO 富集分析发现，苦苣菜治疗急性肝损伤的生物过程主要富集在对外源性刺激的反应、凋亡过程正向调控、受体复合物、膜筏、细胞溶质、酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等生物学过程。通过KEGG 富集分析发现，其主要富集在癌症信号通路、FcεRI 信号通路、IL-17 信号通路、乙型肝炎等通路。其中癌症通路为显著性最高的通路，FcεRI信号通路、IL-17 信号通路等为显著性较高的通路。TNF、TP53、PPARG、ESR1 等调节炎症反应、肿瘤细胞发生发展的关键靶点均处于癌症通路中，对外源性刺激的反应、凋亡过程正向调控、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性的靶点在PPI 网络中也处于核心地位，说明苦苣菜可能是通过调节肝脏中这些关键靶点、关键生物过程来调控癌症通路等高显著性通路以起到抗炎、抗肿瘤、抗氧化的关键作用，因此可用于治疗急性肝损伤。此外，已有研究表明FcεRI 信号通路为免疫炎症中的关键通路，药物、乙肝丙肝病毒可以通过外源性刺激肝脏肥大细胞释放IgE 介质，激活该通路引起TNF-α 的释放，诱发炎症导致肝纤维化乃至肝癌[23]。结果提示，苦苣菜还可调节FcεRI 信号通路中相关联的MAPK 信号通路、TNF-α等关键靶点起到拮抗药物、病毒性肝损伤的重要作用。TNF-α 是极其重要的系统性炎症因子，同时也是属于引起急相反应的众多细胞因子中的一员，与急性肝损伤的发病息息相关[24]，而其余高显著性通路如IL-17信号通路、乙型肝炎等炎症通路，IL-17 通过激活IL-17RA、RC 受体间接激活MAPKs，进而激活核内TNF-α 的转录、翻译引发急性炎症及损伤。苦苣菜的施加可以作用于IL-17、MAPKs、TNF-α 等关键靶点，调节该通路。可见苦苣菜活性成分可以通过抑制急性炎症通路，起到治疗急性肝损伤的作用。

综上所述，本研究通过应用网络药理学的方法对苦苣菜治疗急性肝损伤的活性成分、关键靶点、关键通路等进行探究，从分子学水平对其治疗机制进行系统分析，苦苣菜中芦荟大黄素、积雪草酸、山柰酚等活性成分可以作用于TNF、TP53、PPARG、CASP3 等关键靶点，通过调控癌症通路等多生物学过程、通路起到治疗急性肝损伤的作用，进一步验证了苦苣菜作为药物治疗多种疾病的可能性，为探究苦苣菜治疗急性肝损伤的具体作用机制及新药开发提供了依据。