安罗替尼通过调控miR-16-5p/PD-1轴抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖并促进凋亡

梁香存，魏小雨，梁 健，王 庆，耿 广

河北省胸科医院 肿瘤科，河北 石家庄 050041

肺癌是世界范围内最常见的癌之一,也是死亡率最高的癌种之一[1]。调查显示,肺癌每年新增病例200万,死亡病例约176万[2],其发病率和死亡率不断上升,给社会带来巨大负担。近几十年来,中国针对肺癌的靶向药物研发已经取得了丰硕进展。尤其是分子靶向治疗策略已经在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer cell, NSCLC)治疗中取得了显著成就[3]。安罗替尼(Anlotinib),商品名福可维,是中国自主研发的新型小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂,临床上被用来提高NSCLC患者的存活期[4]。微小RNA(microRNA, miRNA)是一段长度约为18～22 nt的内源性核苷酸单链,其在肿瘤的发生发展中起到重要的调控作用[5]。迄今为止,miR-16-5p在多种癌中扮演抑癌基因的角色,其中包括NSCLC[6]。程序性细胞死亡-1(programmed cell death-1, PD-1) 是T细胞、B细胞和自然杀伤细胞常见的细胞表面受体。在PD-1与其配体结合后,可通过SHP-2抑制T细胞活化,使T细胞受体介导的相关信号Zap 70去磷酸化,最终抑制T细胞增殖[7]。本研究拟以NSCLC细胞系A549和H1299细胞为研究对象,观察安罗替尼对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响,进而揭示安罗替尼与miR-16-5p/PD-1信号轴的相互作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人源非小细胞肺癌细胞系A549和H1299(上海科学研究院细胞库);SPF级6～8周龄的雄性BALB/c-nu裸鼠[北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2020-0004];安罗替尼(正大天晴药业集团股份有限公司);DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所);EDU细胞增殖检测试剂盒(广州锐博生物公司);annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);相关小分子试剂(agomiRNA、agomiR-16-5p、si-NC、si-PD-1)和质粒[pcDNA 3.1(+)-PD-1、pGL3-PD-1-WT、pGL3-PD-1-MUT](上海吉玛公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的分组及处理:首先,将无菌水制备的10 nmol/L安罗替尼母液加入A549和H1299细胞中,使其终浓度分别为0、10和20 μmol/L。孵育48 h后,利用LipofectamineTM3000将相关的小分子试剂和质粒分别转染至A549和H1299细胞中,包括agomiRNA、agomiR-16-5p、si-NC、si-PD-1、pcDNA3.1(+)、pcDNA(+)-PD-1、pGL3-PD-1-WT和pGL3-PD-1-MUT,转染12 h后,更换新鲜培养液,48 h后,收集细胞,用于后续研究。

1.2.2 CCK-8实验检测细胞增殖: 将A549和H1299细胞以2×103个/孔分别接种于96孔板。待细胞贴壁后,每孔加入20 μL的CCK-8试剂,避光孵育20 min。用酶标仪检测细胞在490 nm的吸光度(A)。计算各组细胞增殖抑制率(%)。细胞增殖抑制率(%)= [(A490对照组-A490实验组)/A490对照组]×100%。

1.2.3 EDU实验检测细胞增殖:将A549细胞和H1299细胞以3×105个/孔分别接种于24孔板。用红色荧光染料EDU标记细胞。4%多聚甲醛固定。Triton×100细胞膜通透,DAPI核染色。最后,荧光显微镜下成像分析,计算EDU阳性率(%)。EDU阳性率(%)= EDU阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:收集1×106个细胞,预冷的PBS洗涤3次,用500 μL缓冲液制成单细胞悬液。随后,加入5 μL的annexin V-FITC,混匀,避光孵育10 min,再加入5 μL的PI,混匀,继续孵育15 min。最后,利用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blot检测PD-1蛋白表达:收集细胞,用RIPA裂解液冰上裂解,提取总蛋白。Bradford法定量总蛋白浓度,沸水浴变性。等量蛋白用10%的SDS-PAGE胶电泳。待蛋白分离后,将蛋白转移至PVDF膜。随后,脱脂奶粉封闭处理。用PBS稀释的鼠抗PD-1(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗37 ℃孵育2 h。洗膜,滴加ECL显影液,显色曝光。利用Image J分析条带吸光度。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验检测miR-16-5p与PD-1的靶向性:首先,利用Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)数据库评估miR-16-5p与PD-1之间的作用靶点。根据预测到的靶点信息设计合成pGL3-PD-1-WT和pGL3-PD-1-MUT质粒,构建荧光酶报告基因载体。随后将上述报告基因载体分别与agomiRNA、agomiR-16-5p、antagomiRNA以及antagomiR-16-5p共转染至A549细胞。按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明,检测A549细胞中的荧光素酶活性。

1.2.7 移植瘤模型实验检测安罗替尼对A549细胞成瘤性的抑制能力:将BALB/c-nu裸鼠随机分为3组,即对照组、安罗替尼组、阳性组,每组6只。将处于增殖期的A549细胞,制备成单细胞悬液。用生理盐水调整浓度至2×1010/L,在无菌条件下每只裸鼠右侧腋窝皮下注射0.2 mL。阳性组灌胃4 mg/kg顺铂处理,安罗替尼组灌胃50 mg/kg安罗替尼处理,对照组灌胃等体积生理盐水,1次/d,持续28 d。记录各组小鼠移植瘤体积,并且麻醉处死各组小鼠后,记录移植瘤体质量。移植瘤体积(mm3)=(长×宽2)/2。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 安罗替尼对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响

与对照组相比,安罗替尼组细胞增殖抑制率显著升高,Edu阳性率显著降低,凋亡率显著升高(P<0.05)(图1)。

A.cell proliferation was detected by EDU assay; B.Cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining; C.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;*P<0.05 compared with control group.

2.2 安罗替尼调控NSCLC中的miR-16-5p和PD-1表达

与对照组相比,安罗替尼组细胞miR-16-5p表达显著升高,PD-1的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)(图2)。

A.miR-16-5p expression; B.expression of PD-1 mRNA; C.expression of PD-1 protein;*P<0.05 compared with control group

2.3 miR-16-5p直接靶向结合PD-1 3′UTR

Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)预测 miR-16-5p和PD-1之间的结合序列(图3A)。双荧光素酶报告实验结果显示,仅agomiR-16-5p组PD-1 3′UTR-WT细胞的荧光活性明显降低,agomiR-16-5p组PD-1 3′UTR-MUT细胞、antagomiR-16-5p组PD-1 3′UTR-WT细胞、antagomiR-16-5p组PD-1 3′UTR-MUT细胞的荧光活性均未发生明显变化(图3B)。与agomiRNA组相比,agomiR-16-5p组细胞PD-1的mRNA和蛋白表达均显著降低,与antagomiRNA组相比,antagomiR-16-5p组细胞PD-1的mRNA和蛋白表达均显著升高(均P<0.05)(图3C、D)。

2.4 过表达miR-16-5p对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响

与agomiRNA组相比,agomiR-16-5p组细胞miR-16-5p表达显著升高,细胞增殖和凋亡率均显著升高,EDU阳性率显著降低(P<0.05)(图4)。

A.miR-16-5p expression; B.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;C.cell proliferation was detected by EDU assay; D.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining;*P<0.05 compared with agomiRNA group.

2.5 敲减PD-1对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响

与si-NC组相比,si-PD-1组细胞PD-1的mRNA和蛋白表达均显著降低,细胞抑制率和凋亡率均显著升高,EDU阳性率显著降低(P<0.05)(图5)。

A.PD-1 mRNA expression; B.PD-1protein expression;C.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;D.cell proliferation was detected by EDU assay; E.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining;*P<0.05 compared with si-NC group.

2.6 过表达PD-1逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对A549细胞的生物学行为

与20 μmol/L组相比,20 μmol/L+agomiR-16-5p组细胞miR-16-5p表达显著升高,细胞抑制率和凋亡率均显著升高,EDU阳性率显著降低(P<0.05);与20 μmol/L+agomiR-16-5p+pcDNA组相比,20 μmol/L+agomiR-16-5p+pcDNA-PD-1组细胞miR-16-5p表达显著降低,细胞抑制率和凋亡率均显著降低,EDU阳性率显著升高(P<0.05)(图6)。

A.miR-16-5p expression in A549 cells; B.cell proliferation was detected by CCK-8 assay in A549 cells;C.cell proliferation was detected by EDU assay in A549 cells; D.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining in A549 cells; *P<0.05 compared with 20 μmol/L group; #P<0.05 compared with 20 μmol/L +agomiR-16-5p+pcDNA group.

2.7 裸鼠移植瘤实验

体内实验结果显示,与对照组相比,安罗替尼组瘤体积(7 d、14 d除外)和瘤质量明显降低(P<0.05)(图7)。

*P<0.05 compared with control group.

3 讨论

安洛替尼是一种新型口服酪氨酸激酶抑制剂,作为一种新型分子靶向药物能够靶向血小板衍生生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体和血管内皮生长因子受体。在晚期NSCLC 患者的3期试验中,安罗替尼能够明显提高患者的总生存期和无进展生存期[4]。然而,安罗替尼治疗NSCLC的机制仍需深入研究[8]。本研究初步探索了安罗替尼抗NSCLC的作用以及与miR-16-5p/PD-1信号轴的关系。

已有的研究证明,miR-16在人类多种癌中发挥重要的抑癌作用,包括乳腺癌、宫颈癌、和膀胱癌等[9-11]。例如,miR-16作为长链非编码RNA(lncRNA)XIST的下游靶点,通过靶向CDK8抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭,同时阻滞细胞周期[13]。然而,关于miR-16-5p作为抗癌药物作用靶点的研究尚少。本研究发现在A549和H1299细胞中miR-16-5p的表达水平与安罗替尼的浓度呈正相关,即安罗替尼能够上调miR-16-5p表达。进一步研究发现,过表达miR-16-5p能够显著抑制A549和H1299细胞增殖,促进细胞凋亡。

PD-1/PDL-1阻断抗体通过调节免疫细胞和肿瘤细胞之间的相互作用发挥肿瘤抑制剂的作用。PD-1阻断剂在多种恶性肿瘤中具有显著的临床疗效,尤其NSCLC[12]。研究显示,PD-1在55%的NSCLC患者中高表达,利用PD-1阻断剂治疗的NSCLC晚期患者的无进展生存期显著延长[13]。另外,PD-1抗体联合安罗替尼对发生肝、脑转移的NSCLC患者表现出良好的可耐受毒性和抗肿瘤活性[14]。本研究结果显示,PD-1的表达水平与安罗替尼的浓度呈负相关,PD-1是miR-16-5p的下游靶基因。降低PD-1表达能够明显抑制A549和H1299细胞增殖,促进凋亡;相反,过表达PD-1可逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对NSCLC细胞增殖的促增殖、抗凋亡作用。

综上所述,安罗替尼能够抑制NSCLC细胞增殖,促进凋亡,其机制可能与miR-16-5p/PD-1信号通路相关。因此,本研究为安罗替尼用于NSCLC的治疗提供了一定的实验数据和理论基础。