结直肠神经内分泌肿瘤细胞突变类型分析

王婷婷，郭 丹，陆君阳，徐 徕，董海涛，林佃新，肖 毅*

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.医学科学研究中心；2.临床生物样本库；3.基本外科；4.口腔科，北京100730；5.莱钢集团莱芜矿业有限公司职工医院 内科，山东 济南 271100

胃肠胰神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors,NETs)根据发病位置不同划分NETs不同类型。NETs发病隐匿,往往恶性程度高。其中,胰腺NETs是胰腺癌中恶性程度非常高的肿瘤。而结肠直肠NETs是胃肠道中仅次于胰腺NETs发病率,第二常见的NETs,在美国每年的发病率约为0.3～1人/10万人[1],在中国的发病率与之相近,在过去40年中,结肠直肠NETs的发病率有所增加[2]。近几年,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)根据肿瘤增殖活性将神经内分泌瘤分为3种基本级别[3],包括NETs G1、G2和G3,其中G3也称为神经内分泌癌(neuroendocrine carcinomas,NECs)[4-5]。分级标准包括组织学和增殖活性,主要以Ki67阳性指数和核分裂象数作为指标。其中G1:Ki67阳性指数<3%,核分裂象数<2个/10 HPF(high power field);G2: Ki67阳性指数为3%～20%,核分裂象数为2～20个/10 HPF;G3: Ki67阳性指数>20%,核分裂象数>20个/10 HPF。

目前,结直肠NETs的发病机制尚不十分清楚。目前已有研究对NECs的一些生物标志物和分子特征进行了分析,如p53的异常表达[6],Rb-p16通路的破坏[7],Wnt-β-catenin通路和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)[8],以及APC、KRAS和BRAF等的基因突变[3]。最近的研究表明,NECs与腺癌更为一致,可能与腺癌来源相同,而非高分化神经内分泌肿瘤(NETs G1和G2)[3,6,9]。这些报道大多基于病理结果得出这一结论,使用石蜡包埋样本而非新鲜样本推断大肠NECs和腺癌的共同克隆起源[10]。目前通过全基因组或全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)对大肠NECs进行的研究很少(主要原因多数是样本较难获取)。因此,全基因组或全外显子组水平上的高分化结直肠NETs的基因特征尚不清楚,全基因组水平上的NETs G1、NETs G2和低分化NECs G3之间的关系也不清楚。

随着测序技术的发展,各种突变类型也被解析出来,常见的基因突变类型包括:1)点突变;2)插入-缺失突变(insertion and deletion,InDel,长度小于50 bp);3)基因拷贝数变异(copy number variations,CNV);4)反转录:指 RNA 分子通过反转录转录成 DNA,再插入到基因组中的过程;5) 染色体结构变异(structural variation,SV,长度大于50 bp):包括大片段的插入(insertion,INS),缺失(deletion,DEL),染色体内易位(intra-chromosomal translocation,ITX)、染色体间易位(inter-chromosomal translocation, CTX)和反转(inversion,INV)等;6)染色体数目变异:指染色体数目增加或减少,可能导致基因副本数目的改变。

本研究通过招募结直肠NETs手术患者,术中取NETs和对照正常组织(癌旁组织),并进行全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS),并进一步深入分析。发现结直肠NETs突变类型包括:单核苷酸突变、InDel、CNV, 以及染色体结构变异(包括INS、DEL、ITX、CTX和INV)等。本研究得出结论,结直肠NETs发生时,体细胞发生了大量的突变,尤其以染色体CTX变异最为显著。本研究在WGS水平上分析了结直肠NETs的基因突变特征,有助于更好地理解结直肠NETs的发病机制,并为未来肿瘤治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 患者招募及样本取材

本项目所有患者相关流程均已由北京协和医院伦理标准审查委员会批准(批准号:S-K431),共招募了9例结直肠NETs手术患者,所有患者都签署了知情同意书。这些患者于2017年1月至2018年12月在北京协和医院基本外科接受了手术切除,所有病例均按照WHO标准进行分类[4]。招募条件:符合结直肠NETs G1,NETs G2,NECs,以及杯状细胞类癌(goblet cell carcinoid tumors,GCC)患者,肿瘤的定性和分级由2名及以上病理医师进行确认,所有患者肿瘤病灶均为原发。术中取材,分别取结直肠NETs患者肿瘤和对应的癌旁组织(病理学家通过病理切片证实的无肿瘤细胞的组织)。为了对患者信息进行保密,把患者信息(姓名和身份证)进行了模糊化处理,并分配了新的编号。

1.2 二代测序

使用Illumina测序平台进行全基因组测序[11],测序在诺禾致源公司完成,肿瘤的平均深度为60倍,对照(癌旁)样本的平均深度为35倍。

1.3 生物信息学和统计学分析

使用SAMtools(v1.0)、muTect(1.1.4版)、Strelka(v1.0.13版)、crest(v 0.0.1版)和control-FREEC(v6.7版)分别检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)、体细胞单核苷酸变异(single nucleotide variants,SNVs)、体细胞插入缺失突变(InDel)、结构变异(包括INS、DEL、ITX、CTX和INV等)检测,以及拷贝数变异(CNV)检测等分析。使用NMF(版本0.22)进行突变谱和突变特征分析。使用Student t检验或Mann-WhitneyU检验评估了两组之间的显著差异。SMG分析采用卷积试验(CT)。

2 结果

2.1 患者特征

本研究的整体过程(图1)。本项目招募了9例患者,包括7例切除的结直肠NETs、1例结直肠NEC和1例GCC。长期以来,关于GCC与NETs或腺癌的关系一直存在争议,这次选了一位GCC患者作为对照。9例患者的基本临床病理信息见表1。9例患者的瘤体组织和癌旁对照提取DNA后,用于WGS全基因组测序。

图1 研究流程图Fig 1 Overview of the study workflow

表1 结直肠NETs患者的临床病理信息Table 1 Clinicopathological information for the colorectal NETs patients

2.2 疾病突变特征

WGS测序发现结直肠NETs突变类型包括: SNP、InDel(长度在50 bp以下)、CNV,以及SV(长度在50 bp以上),包括: INS、DEL、ITX(发生在同一条染色体内)、CTX(发生在两条同源或非同源染色体之间)和INV等。本研究发现结直肠NETs发生时,瘤体细胞发生了大量的突变(图2),尤其以染色体易位CTX变异最为显著,并且跟G1相比,G2级别的结直肠NETs染色体CTX变异更多(表2)。跟癌旁对照相比,结直肠NETs中检测发现大量染色体结构变异(表2),平均变异数目11 382个,这些变异主要集中在细胞周期及调控相关通路或肿瘤抑制相关通路,尤其引起ATM、MEN1等重要调控基因变异,继而引发相关蛋白表达异常。

表2 体细胞染色体结构变异统计结果Table 2 Statistical results of somatic variation

The first circle of each ring from outside to inside, sequencing coverage map; In the second circle, the green dot indicates the density of SNP / indel; In the third circle, CNV results, red indicates that the number of copies increases, blue indicates that the number of copies is missing, and green indicates that the number of copies is normal; In the fourth circle, SV results, where CTX(orange), INS(green), DEL(gray), ITX(pink) and INV(blue).

3 讨论

本研究通过收集结直肠NETs和其癌旁组织对照,并进一步利用WGS测序,分析了不同级别结直肠NETs中突变类型,并进一步统计了瘤体细胞结构性变异的种类特点,有助于更好理解结直肠NETs发病的可能机制,为未来肿瘤治疗提供理论基础。通过对多种突变类型包括SNP、InDel、CNV,以及SV(INS、DEL、ITX、CTX和INV等)分析,发现结直肠NETs发生时,基因组序列变异明显,尤其以染色体易位CTX变异最为显著,并且跟G1相比,G2级别的结直肠NETs染色体CTX变异更多,这些变异主要集中在细胞周期及调控相关通路或肿瘤抑制相关通路。提示易位等染色体大范围的变异,在结直肠NETs发生中可能起重要作用。研究显示,在胰腺NETs中,4条信号通路基因突变变化最明显,包括 DNA损伤修复、染色质重塑、端粒维持,以及mTOR信号激活,这些突变可能和胰腺NETs临床分型相关[12-13]。本研究发现染色体易位CTX 变异和结直肠NETs的不同分级相关,跟高分化的G1相比,G2级别的结直肠NETs染色体CTX变异更多。

此项研究中也有一些局限性。结肠直肠NETs项目的研究难点在于,大多数结肠直肠NETs都是在结肠镜检查时发现的,肿瘤较小(大多数直径不超过10 mm)。活检组织优先用于病理检查,收集新鲜的结直肠NETs样本异常困难。本研究仅收集了8例结肠直肠NETs/NECs和1例GCC患者的瘤体和对应癌旁组织进行WGS测序,样本量偏小,也是本研究的主要局限所在。