半夏泻心汤治疗化疗性肠黏膜炎的作用机制探讨*

陈孟瑶，肖晓燕，苏联麟，王雅慧，颜帅

1 南京中医药大学附属苏州市中医医院 江苏苏州 215009

2 南京中医药大学药学院 江苏南京 210023

结直肠癌是世界范围内发病率和病死率最高的常见癌症之一，手术治疗联合化疗是结直肠癌的目前主流治疗方法[1]。晚期患者辅助化疗杀伤肿瘤细胞的同时，亦导致正常上皮细胞损伤，产生严重的胃肠道毒性，从而出现结构、功能和免疫学改变黏膜损伤——化疗性肠黏膜炎（Chemotherapy-induced intestinal mucositis，CIM）[2]，严重影响肿瘤的治疗进程及预后。目前针对CIM的管理以支持性护理为主，辅助用药，治疗效果欠佳，且部分药物价格高昂，即使遵循指南联合用药，化疗性肠黏膜炎的总体控制率有限，临床上缺乏行之有效的方法[3]。因此，研究影响CIM发生的因素，寻求高效低毒、经济、患者接受度高的辅助干预手段，抑制或阻断CIM产生的根本必要途径，有助于改善结直肠癌化疗患者的预后，对其复发转移治疗和提高生活质量有重大的意义。中医认为，CIM临床症状属于“泄泻”“痢疾”等范畴，病位主要在脾胃和大小肠，主要病机为机体受湿热、疫毒、寒湿结于肠腑，气血壅滞，大肠传导失司，属寒热并存、虚实夹杂证，因此，以清上温下、平调寒热、扶正祛邪为主要治法[4]。

半夏泻心汤作为《伤寒论》经典类方，2018年选入《古代经典名方目录（第一批）》[5]。临床应用广泛，它由半夏、黄连、黄芩、干姜、甘草、人参、大枣7味药组成[6]。该方具有调和肝脾、平调寒][热、消痞散结之功效，主治寒热错杂之痞证，现代常用于治疗胃肠炎、胃溃疡等胃强脾弱、寒热错杂症[7-8]以及胃癌术后状态[9]等，是极具潜在开发意义的经典名方。半夏泻心汤的适应症与CIM的典型症状相对应，且已有研究表明半夏泻心汤能够有效防治炎症性肠病，增强免疫活性，降低炎症，保护胃肠黏膜[10-11]。

基于半夏泻心汤治疗CIM的相关研究匮乏，本文筛选获得半夏泻心汤的潜在活性成分，并预测活性成分的潜在治疗CIM靶点，构建“成分-靶点”网络图，挖掘潜在活性成分的治疗CIM的核心靶点并预测作用机制。最后运用分子对接验证半夏泻心汤治疗CIM机制，为挖掘半夏泻心汤治疗CIM有效成分及作用机制提供参考。

方法

1 半夏泻心汤活性成分和靶标筛选

借助TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），对半夏泻心汤中的7味组成药物（半夏、黄连、黄芩、干姜、甘草、人参、大枣）进行检索，初步筛选获取口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18的成分及其对应的蛋白质靶点。利用Uniprot蛋白质分析数据库（https：//www.uniprot.org）获得靶蛋白对应的靶基因名称，删除没有靶点的活性成分与重复的靶基因，获得活性成分与相关靶点。

2 半夏泻心汤治疗CIM靶点预测及药物与疾病共同靶点获取

以“Chemotherapy-induced intestinal mucositis”为关键词对GeneCards数据库（https：//www. genecards.org）、OMIM数据库（https：//omim.org/）、TTD数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）和Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca/）进行检索，筛选相关靶点。整合各数据库筛选结果，删除重复的靶点，即得到CIM的相关靶点。将半夏泻心汤活性成分靶点与CIM靶点取交集，通过venny 2.1.0绘制韦恩图，得到半夏泻心汤与疾病CIM的共同靶点。

3 化学成分与疾病靶点网络的构建

运用CytoScape 3.6.1构建化学成分、疾病、靶点网络图。采用软件内置工具分析成分和靶点的连接度、介度、紧密度等网络拓扑参数，以网络拓扑参数分析关键靶点和主要药效成分。为了进一步研究半夏泻心汤的作用机制，利用STRING 11.0数据库（https：//string-db.org）构建交集靶点的蛋白互作网络（PPI）。

4 化学成分-疾病靶点功能与通路的富集分析

生物功能注释包括基因本体（gene ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）两部分。将半夏泻心汤治疗CIM的靶点导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），进行GO生物学过程和KEGG富集分析。结果利用微生信（http：//www. bioinformatics.com.cn/?p=1）实现可视化。

5 分子对接

利用PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）检索半夏泻心汤治疗CIM的关键活性成分和核心靶点的3D结构并下载，使用AutoDock 4.2在线平台对蛋白及化合物进行去加氢、加电荷处理后，进行对接验证。

结果

1 半夏泻心汤活性成分筛选和靶标预测

经筛选后共获得275种活性成分，其中人参86种，半夏13种，黄芩36种，黄连14种，干姜5种，甘草92种，大枣29种，包括山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、黄芩素（wogonin）和豆甾醇（Stigmasterol）等。半夏泻心汤中不同的中药里面存在相同的化合物的情况。通过数据库找出各药物作用靶点，人参94个，半夏80个，黄芩92个，黄连162个，干姜31个，甘草214个，大枣181个，合并后删除重复值共得到靶点254个。半夏泻心汤的主要化合物及靶标见表1。结果表明半夏泻心汤发挥疗效可能与多种有效成分作用于多个靶点密切相关。

2 半夏泻心汤治疗CIM潜在靶点的预测

利用Genecards、OMIM、TTD、DRUGBANK数据库，最终得到694个相关靶点。韦恩图结果显示，半夏泻心汤与CIM共同靶点有99个，见图1。

图1 半夏泻心汤化学成分和疾病靶点韦恩图

3 半夏泻心汤治疗CIM“化学成分-疾病靶点”PPI网络的构建及分析

CytoScape 3.6.1构建的药物-疾病靶点网络图中总共包括445个节点和3372条边，各药物的化合物分子分别用不同颜色表示，见图2。在网络中，与节点连接的路线条数越多，度值越大，选择较大度值的节点进行分析，这些节点可能是关键的化合物或者靶点。网络图中表明，各化学成分平均与7.56个靶点相互作用，即半夏泻心汤中一个化学成分与多个靶点相互作用，同时也存在多个成分作用于一个靶点的现象。以上结果体现了半夏泻心汤多成分与多靶点之间共同作用的机制。

图2 药物-疾病-活性成分-靶点网络图

利用STRING 11.0初步绘制的半夏泻心汤靶点PPI网络，见图3中（1）部分，并分析获得12个核心作用靶点，见图3中（2）部分，包括TNF、IL-10、IL-1B、IL-6、ALB、ERBB2、EGF、EGFR、ERBB3、PLAU、PTEN、TP53，可能是半夏泻心汤治疗过程中的核心靶点。

图3 蛋白互作网络图

4 富集分析

GO功能富集分析得到了701个与CIM疾病密切相关的条目，包括564个生物过程（Biological Process，BP）条目，主要涉及无配体时的外源性凋亡信号通路，基因表达的正向调控，细胞对缺氧的反应，对缺氧的反应等；46个细胞组成（Cellular Component，CC）条目，主要涉及细胞核，胞浆，核质，细胞外空间等；91个分子功能（Molecular Function，MF）条目，主要涉及蛋白质结合，相同的蛋白质结合，酶结合，蛋白质均二聚活性等。BP、CC和MF所占比例为80.46%、6.56%和12.98%，见图4。KEGG通路富集分析得到与半夏泻心汤治疗CIM作用机制相关的115条信号通路（P＜0.05），富集程度较高的通路包括结肠直肠癌，TNF，HIF-1，NOD，VEGF等，见图5。

图4 GO分析

图5 KEGG分析

5 有效成分及核心靶点的分子对接

根据PPI网络拓扑分析及相关文献，选取EGFR、TNF、IL6与半夏泻心汤的主要活性成分山奈酚、槲皮素、黄芩素进行分子对接。结合能小于-5.0 kcal·mol-1，表明成分与靶点的结合活性良好[12]。分子对接结果显示，半夏泻心汤中的主要活性成分与核心靶点具有较好的结合活性，尤其是EGFR与山奈酚、槲皮素、黄芩素具有强结合力。结果见表2。利用PyMOL软件对对接结果可视化分析，展现其构象关系，结果见图6。

表2 成分与靶点结合能

讨论

从中医基础理论来讲，CIM的发生是由于机体受湿热、疫毒、寒湿结于肠腑，气血壅滞，大肠传导失司所致，属寒热并存、虚实夹杂证，因此主要以清上温下、平调寒热、扶正祛邪为治则[13]。现代临床表现为腹痛、腹泻、便秘、麻痹性肠梗阻、消化道溃疡、甚至胃肠出血等[14]。半夏泻心汤味辛、苦、甘，能够导滞止痛，和胃气，散寒滞，清胆泄热，健脾益气[15]。临床广泛应用于消化系统溃疡[16]、慢性胃炎[17]等脾胃消化系统疾病的治疗，又因其能调寒热、升降，能补能泻等，临床应用广泛，疗效显著，是具有重大潜在开发价值的经典名方[18]。

本研究通过网络药理学及分子对接探析半夏泻心汤治疗CIM的潜在作用机制，研究结果显示：半夏泻心汤中共有275个活性成分，集中在甘草、人参、黄芩3味中药，槲皮素、山柰酚、黄芩素为主要的活性成分。槲皮素是广泛存在的黄酮类化学物，具有抗氧化、抗炎、调节肠道菌群等作用，涉及Mincle/Syk/NFκB、NF-κB/i NOS/NO、Nrf2/HO-1、TGF-β1、PI3k/Akt等多个信号通路[19]。山柰酚在抗氧化、抗炎等方面有一定的作用，可通过调节TNF-α、IL-6相关信号通路，抑制炎症反应[20]。黄芩素具有抗炎、抗菌以及抗肿瘤活性等，研究表明黄芩素对CIM有治疗作用，可以降低血清的IL-6和TNF-α含量，显著调节肠道菌群[14]，与本研究验证结果一致。

基因靶点网络体现了半夏泻心汤多成分与多靶点之间共同作用的机制。PPI结果表明IL-6、TNF、EGF、EGFR、IL-10等12个靶点为半夏泻心汤治疗CIM的关键靶点。炎症因子IL-6作为C反应蛋白上游的炎症因子参与炎症和免疫反应，在肠黏膜炎的发生和发展中起着至关重要的作用[21]。TNF具有炎症介质作用，与非特异性炎症反应密切相关，其可能涉及的肠道免疫调节、肠黏膜屏障缺陷等多个病理生理过程对临床评估CIM具有重要价值[22]。EGFR的表达可使损伤肠黏膜细胞增殖，从而修复受损组织[23]。

GO富集分析结果表明，半夏泻心汤治疗CIM的生物过程主要包括无配体时的外源性凋亡信号通路，基因表达的正向调控，细胞对缺氧的反应，对缺氧的反应等，与炎症的形成与发展密切相关。KEGG通路富集结果表明，半夏泻心汤治疗CIM的信号通路主要有结肠直肠癌，TNF，HIF-1，NOD，VEGF等，集中在炎症反应、肠道疾病等方面。

将核心靶点TNF、EGFR、IL-6与活性成分槲皮素、山奈酚、黄芩素对接后获得的结合能均远小于参考值-5.0kcal/mol，表明半夏泻心汤活性成分能与CIM的核心靶点受体蛋白稳定结合，并发挥显著作用，验证结果表明基于此得到的网络分析结果可信度高，具有重要的参考意义。

综上所述：通过网络药理学研究，分析其潜在的核心靶点、生物学功能和信号通路，揭示其潜在的分子生物学机制。本研究为半夏泻心汤治疗CIM的临床研究提供了理论依据和参考。本研究仍存在一定的局限性。仅采用现代生物信息学方法，通过使用网络药理学和分子对接方法来探讨半夏泻心汤在CIM中的作用。但目前的网络信息技术还有待进一步完善，数据库数据的准确性和及时性有待科学验证。同时，那些未经证实和未记录的化合物或靶点可能不包括在我们的分析中。虽然槲皮素、山奈酚、黄芩素在本研究中被确定为半夏泻心汤治疗CIM的三个最重要的生物活性成分，但它们不能完全代表半夏泻心汤。因此，需要考虑药效学实验和分子生物学实验来进一步验证目前的研究结果。