子宫内膜乳酸杆菌主导的微生物群与生殖的关系

张碧云 钟兴明 王晓霞 刘晓华

1广东省生殖医院（广东省生殖科学研究所）生殖免疫科（广州 510600）；2国家卫生健康委员会男性生殖与遗传重点实验室（广州 510600）；3广东省生殖科学研究所中心实验室（广州 510600）

曾经长达一个世纪以来，人们认为阴道、宫颈等下生殖道存在微生物群，而子宫等上生殖道一直被认为是无菌的环境。而近年来随着16S 核糖体RNA（16S rRNA）等高通量测序技术的快速发展，发现和识别越来越多的子宫内膜微生物定植，这为子宫为非无菌环境提供了有力的证据［1］。由于在宫颈管、宫腔等部位及输卵管、卵巢及腹膜液等检测到与阴道不同的微生物群落，故而认为：微生物群在女性生殖道内存在且连续分布，生殖道是一个非无菌环境［2］。生殖道微生物组的评估为人类生殖、妊娠的起源及维持等提供了新的微生物学视角，且随着对这类微生物群功能的研究的深入，发现子宫内膜微生物群（endometrial microbiota，EM）对维持女性妊娠及生育等生殖过程至关重要。子宫内膜微生物群对自然生育与辅助生殖过程均产生影响，关于生殖道微生物群对生育、流产、复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）［3］、反复种植失败（repeated implantation of embryos failed，RIF）［4］等的影响已经引发国内外学者的关注，但是目前尚缺乏统一的观点及数据［5-6］。本文将初步探讨子宫内膜乳酸杆菌主导的微生物群（LDM）生殖结局的关系，为人类生殖生育提供了新的微生物学视角。生殖道微生物组的评估，为人类生殖生育提供了新的微生物学视角，微生物群落评估展现了对改善生殖医学和妇女健康越来越明显的重要性。

1 子宫内膜微生物群与慢性子宫内膜炎

子宫内膜微生物群是指定植于子宫内膜的微生物及其基因组的总和。慢性子宫内膜炎（chronic endometritis， CE）病理表现为子宫内膜间质区浆细胞浸润，而临床表现方面没有特异性。CE 诊断的金标准是基于子宫内膜活组织的病理检查［7］。慢性子宫内膜炎常见于革兰阴性菌株感染，如大肠杆菌及阴道加德纳菌，除了其内毒素可以直接损伤人类植入前卵裂率、胚泡形成率及胚胎着床率之外，蛋白TLR4 也对胚胎植入有负面生物学效应。目前发现，子宫内膜中常见的致病病原体有：（1）细菌：如大肠埃希菌、粪肠球菌、链球菌属、葡萄球菌；（2）变形杆菌属；（3）肺炎克雷伯菌；（4）阴道加德纳菌；（5）脲原体/支原体：生殖支原体、人型支原体、解脲脲原体；（6）棒状杆菌；（7）铜绿假单胞菌；（8）结核分枝杆菌；（9）酵母菌等［8］。

慢性子宫内膜炎与生殖关系密切。KIMURA等［9］研究表明，慢性子宫内膜炎在不孕女性中的患病率为2.8%～56.8%，在反复移植失败RIF 中发病率为14%～67.5%，在复发性流产RSA 中发病率为9.3%～67.6%。KITAYA 及VITAGLIANO 等［10-11］的研究也表明，RIF 的不孕症与CE 密切相关。已知子宫内膜微生物菌群失调还与多种妇科疾病有关，例如子宫内膜异位症［12］、子宫内膜癌等［13］。随着胚胎RIF、RSA 及不明原因不孕等问题，有效诊断及治疗CE 引发的负面影响在生殖领域受到了广泛关注。有效的抗生素治疗CE 可以提高不明原因复发性妊娠丢失（RPL）患者的妊娠率和活产率，并增加复发性植入失败RIF 患者的持续妊娠率［14］。

2 子宫内膜微生物群对生殖功能的作用机制

目前观点认为，子宫微生物群从以下几方面影响内膜上皮的病理生理学功能，并影响生殖结局。

2.1 改变子宫内膜容受性子宫内膜容受性可能受到基因、蛋白、细胞因子等多因素调控。正常育龄女性的胚胎着床窗口期为3～6 d，在某些炎症或解剖改变的情况下，该窗口期会变窄或移位以阻止正常着床，导致不孕或妊娠丢失。在维持正常妊娠的着床中，胚胎和子宫内膜均承担了相应的责任［15］。免疫细胞对胚胎着床和子宫内膜容受性至关重要。它们发挥组织重塑和免疫调节作用，促进上皮附着能力，调节蜕膜细胞的分化，重塑子宫血管，控制和消除炎症激活，排斥对父系遗传异体抗原的破坏性免疫。从生物学的角度来看，子宫内膜免疫反应发挥了一种“质量控制”——在条件有利时促进着床，但在环境不理想时限制着床。RIF 和RSA 者可能表现出某些子宫免疫细胞群的数量改变或功能紊乱［16］。反复种植失败RIF 合并有慢性子宫内膜炎CE 的患者，血免疫球蛋白IgM、IgA 和IgG 的表达增高。慢性子宫内膜炎情况下，定植在内膜的微生物群与宿主免疫之间失衡，继而产生相关细胞因子及免疫因子，并影响子宫内膜容受性［17］。

2.2 改变生殖道的pH 值女性生殖道内的pH 值呈梯度变化，阴道内pH 值最低（平均pH 值4.42）向输卵管（平均pH 值7.94）逐渐升高，反映了部位特异性微生物群和组织/细胞酸碱缓冲的变化。pH 值的波动对精子功能、卵母细胞成熟和胚胎发育都有重要影响，胚胎和卵母细胞内存在pH 值的调节机制［18］。众所周知，阴道存在“自净作用”。阴道是一个开放的微生态环境，在正常阴道微生态中，起主导作用的是产过氧化氢的乳酸杆菌，阴道内乳酸杆菌下调阴道的pH 值，产生过氧化氢，抑制了致病菌的增殖、黏附及定植，使入侵的微生物无法获得足够的营养，从而不能大量增殖。细菌性阴道病BV 等妇科疾病与阴道pH 值升高即和乳杆菌菌落减少有关［19-20］。由于阴道、宫颈、子宫内膜的酸碱度对胚胎种植、着床的重要性，而生殖道的pH 值又与微生物群密切相关，故而许多学者尝试从微生物群结构调整局部pH 值，以提高自然妊娠或者辅助生殖妊娠着床的成功率。

2.3 影响生殖道上皮屏障的完整性健康的宫颈阴道微生物群维持宫颈上皮屏障的完整性并调节黏膜免疫系统。微生物群组成及微生物代谢物的变化，引起局部炎症，损害了宫颈上皮和免疫屏障，增加对性传播感染的易感性和相关疾病的进展［21］。生理情况下，子宫内膜共生微生物群与内膜上皮细胞之间，可形成抵御病原微生物的物理屏障，两者相结合诱发各种具有抗菌活性的天然肽，这些肽可以保护细菌、病毒和真菌等病原体的定植，从而直接影响细菌群落平衡，并可能是帮助胚胎着床和维护健康环境的主要参与者，如参与上皮组织抵御各种病原体的蛋白水解酶的形成［22-23］。不同的细菌群落能够通过黏蛋白降解、生物膜形成和抗菌素耐药性等机制，从而导致生态失调状态［24-25］。此外，宫腔微生物群还会诱导子宫内膜细胞产生黏液，并稳定内膜细胞间的紧密连接及黏附联接，并进一步强化了宫腔内膜黏膜屏障的完整性［26-27］。

2.4 改变子宫内膜上皮的基因组稳定性目前的证据有力地表明，有益微生物组可以通过触发身体的免疫反应，维持局部内膜上皮基因组的稳定，来攻击各种生殖系统肿瘤，如：宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌及阴道癌和外阴癌。子宫内膜微生物组成的变化，还影响宿主细胞的免疫和代谢信号，导致血管生成、细胞增殖、基因组不稳定增加，从而可能导致妇科癌症的发生或发展。虽然微生物基因组在妇科癌症中的研究才开始，但已经发现了一些重要的微生物组特征关联性疾病。如：宫颈癌伴随大量人乳头瘤病毒、梭杆菌感染，子宫内膜癌中存在卟啉单胞菌、变形菌门和厚壁菌门细菌水平显著升高。卵巢癌中有沙眼衣原体、乳杆菌和分枝杆菌的增加的报道。反之，乳杆菌可能通过转录因子的调节和其他基因组和表观遗传的改变，降低肿瘤的发病率［28］。

2.5 改变生殖道局部免疫炎症信号通路宫腔微生物通过激活核因子κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）及有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等的信号通路，产生促炎因子，如白细胞介素IL-6 和IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）等［29］。MULLA 等［30］发现RSA 患者中多有抗心磷脂抗体（antiphospholipid antibodies， aPL）阳性，抗磷脂综合征APS 是RSA 的重要免疫病因，并提出以MyD88/TLR-4 通路为靶向提供抗磷脂综合征APS 合并RSA 患者的治疗。笔者的早期研究也表明，胚胎停育炎症组患者的子宫蜕膜组织中TLR4表达高于早孕人流的对照组，而宫腔内膜蜕变组蜕膜组织中的TLR4 表达低于早孕人流对照组。故认为：母体宫腔蜕膜组织TLR4 蛋白的平衡对早孕妊娠维持发挥了重要作用［31］。在生殖领域，控制性超促排卵及黄体支持，也可改变阴道和子宫内膜微生物群的组成：超促排卵及黄体支持降低了子宫内膜中的乳杆菌的相对比例，而增加了普雷沃氏菌和阿托泊菌的比率，从而影响子宫内膜容受性及妊娠结局［32］。CE 的细菌与子宫内膜微环境的相互作用促进了白细胞数量增加、细胞因子产生和生长因子的变化，从而改变子宫内膜容受性，导致胚胎植入失败。

3 子宫内膜LDM 与生殖的关系

3.1 乳酸杆菌及其在女性生殖道的分布乳酸菌是一种无芽孢的杆菌，属革兰氏阳性菌。单个、成双或短链排列。属于细菌界、厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属。乳酸杆菌是可使葡萄糖等糖类分解为乳酸的各种细菌的总称。一般说乳酸杆菌指的是乳酸杆菌属。乳酸杆菌有较强的代谢碳水化合物产酸能力，可以合成葡聚糖和杂多糖，能使糖类发酵产生乳酸或其他酸类物质，产生的乳酸具有调味和防腐的作用。乳酸杆菌属广泛分布于自然界，有些菌株是人和动物口腔、肠道及阴道的正常菌群之一，很少致病，除极偶尔引起亚急性细菌性心内膜炎外，对人基本无害。一般认为，寄生于肠道和阴道的乳酸杆菌对机体有保护作用。 目前已经分离出40 余种乳酸杆菌，来源于动物的阴道分泌物、动物粪便、酸菜及奶酪中，它们均同属于乳酸杆菌属［33］。

VOMSTEIN 等［34］研究发现，阴道有一个高度依赖乳酸菌的微生物群。沿着女性生殖道越往上走，这些部位及生殖管道微生物群中的乳酸菌比例就越低（如宫角及输卵管）。从阴道、宫颈，到子宫腔，乳酸杆菌的优势性下降和菌群多样性的增高均会增加局部感染风险，如：外阴阴道假丝酵母菌病、细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎及需氧菌性阴道炎等［35］。但是，是否所有女性都存在其独特的宫腔菌群，所检测到的细菌是否永久亦或是短暂地存在于宫腔内膜，宫腔内各个菌群的共生关系如何呢，尚需要进一步探讨。

3.2 子宫内膜LDM对生殖的积极证据子宫内膜中存在以乳酸杆菌为主的微生物群（LDM > 90%乳杆菌属）与非乳酸菌为主的微生物群（NLDM，＜ 90%乳杆菌属和＞ 10%其他细菌）两类情况。关于LDM 对生殖结局的影响，多数研究对其持积极态度，认为LDM 有助于生殖结局。

熊霜［36］研究使用16S rRNA 基因V3-V4 区域进行扩增测序，发现厚壁菌门和变形菌门是不孕女性优势菌门，且不孕女性子宫内膜微生物群主要以NLDM为主。KYONO等［37］证明虽然建立LDM 为主的子宫内膜对妊娠结局未必有明显的益处，但结果提示：LDM 子宫内膜在不孕症女性的胚胎着床、植入宫腔过程中起到了正面的积极意义。LIU等［38］的研究报道了复发性流产RSA 患者的上下女性生殖道的微生物群与对照组相比在α 多样性方面没有显著差异，但RSA 组阴道微生物群、宫颈微生物群和宫腔灌洗液微生物群的β 多样性显著高于健康对照组。子宫内膜菌群研究发现，变形菌门（Proteobacteria）成为RSA 患者的主要门类，而厚壁菌门（Firmicutes）则仍在对照组中起主导作用。在RSA 组中，属于变形杆菌的不动杆菌属取代了乳酸杆菌，成为最主要的属。RSA 组中，LDM在子宫内膜菌群中显示出比例减低的趋势［38］。PEURANPÄÄ 等［39］研究发现与对照组相比，反复妊娠丢失RPL 女性子宫内膜样本中crispr 乳杆菌的丰度较低，在子宫内膜和阴道样本中，RPL 组阴道加德纳菌的丰度均高于对照组。VOMSTEIN等［34］研究共纳入10 个无生育史的健康对照，20 个复发性流产RSA患者（定义为至少连续3次流产），20 例反复着床失败RIF（至少3 次胚胎移植失败）。每个受试者在卵泡期、排卵期和黄体期进行子宫冲洗，收集子宫冲洗液。比较复发性流产（RSA）和反复种植失败（RIF）组、对照组在月经周期每个采样时间点的微生物群分类。结果发现，对照组在排卵期前后物种丰富度和均匀度显著下降，微生物群分布更均匀。在门水平RIF 患者在月经周期，特别是在排卵期和黄体期，厚壁菌门数量减少。子宫内膜的LDM 丰度在健康对照组中较RSA 及RIF组中明显减少。故认为：RSA 及RIF 这两个患者群体与对照组相比，LDM 的优势较低。宫腔菌群微环境变化，是容易导致妊娠失败的原因或结果［34］。MORENO 等［40］研究发现行试管婴儿（IVF-ET）患者中NLDM 组的胚胎着床率、妊娠率、持续妊娠率和活产率均较LDM 组显著降低，流产率升高但差异无统计学意义，尤其是当NLDM 组中加德纳菌属和链球菌属比例较高时，这一负面影响更为明显。ZOU 等［41］研究发现，125 例反复种植失败RIF 患者检出子宫内膜致病菌，以链球菌、葡萄球菌、奈瑟菌、克雷伯菌最为常见，占致病组的88.70%。这些宫内膜致病菌，与非乳酸菌为主的微生物群（NLDM）相关。

复发性流产的病因复杂，临床特征具有高度的异质性，涉及生殖免疫学、生殖医学、生殖遗传学、风湿免疫学、妇产科学和检验医学等多学科范畴［42］。关于下生殖道菌群结构与复发性流产的关系，目前尚无定论。而以上研究均表明，LDM 型子宫内膜在降低RSA 或反复妊娠丢失（PRL）及RIF发病方面显示出了积极意义。反之，NLDM 型子宫内膜则产生了流产、RSA 或RIF 等负面的影响。

3.3 子宫内膜LDM 对生殖积极作用的可能机制

3.3.1 LDM 维持母胎免疫平衡当宫腔内膜的致病微生物导致共生微生物群结构、数量紊乱，以及内膜的抗菌屏障损伤、免疫细胞比例失调，且促炎因子释放增加导致代谢产物紊乱，并影响胚胎的着床［43］。母胎界面免疫耐受的本质是胚胎滋养层细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞共同参与母-胎对话的过程，促进母胎界面免疫微环境的转化及适应性免疫的建立，如滋养层细胞浸润、螺旋动脉重塑和胚胎免疫耐受建立等。母胎界面免疫微环境异常会造成母胎免疫耐受稳态失衡，可能是导致RSA 的重要原因［44］。子宫内膜中免疫细胞的数量和功能异常，必然影响胚胎植入的过程及影响妊娠维持。子宫内膜微生物失调导致的免疫稳态失调可能产生慢性炎症，而乳酸杆菌则维持了此免疫平衡的过程［45］。反之，慢性子宫内膜炎患者子宫内膜菌群并非以乳酸杆菌为主，其母胎界面中蜕膜T 细胞呈Th1 和Th17 细胞偏倚，导致了慢性子宫内膜炎者的临床受孕率大大下降［46］。

3.3.2 LDM 加强抗菌屏障LDM 在宫腔内膜可维持完整、稳定的上皮抗菌屏障，并保护子宫内膜免受机会致病微生物的感染、定植及入侵。LDM可提高子宫内膜上皮细胞的胞间连接，是黏膜屏障发挥功能的基础。乳酸杆菌通过提高紧密连接蛋白的表达，来增强上皮细胞的屏障功能。乳酸杆菌还通过这种占位效应，来减少致病微生物群入侵的机会，从而维护黏膜的完整性［47］。

3.3.3 LDM 增加了子宫内膜容受性子宫内膜的容受性受到子宫内膜厚度、血流状态、子宫解剖结构及母体全身疾病及母体生殖道微生物群结构的影响。子宫内膜中乳酸杆菌的数量在子宫内膜容受性中发挥重要作用，LDM 可增加育龄女性子宫内膜的容受性。而随着年龄的增长，LDM 乳酸菌优势菌群在宫腔减少，子宫内膜容受性下降导致的不孕及流产也增加了［48］。

综上所述，子宫内膜LDM 对生育产生了的积极意义，可以维持母胎界面有效平衡，为降低流产、RSA 及RIF 等发挥积极的作用。但是目前有关子宫内膜微生物群与生殖结局的相关性尚未达成共识，尚需要进一步的研究探索。

【Author contributions】ZHONG Xingming helped to provide information.WANG Xiaoxia and LIU Xiaohua helped to look up the information.ZHANG Biyun searched for information， wrote and revised the first draft， and finalized the draft.All authors read and approved the final manuscript submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.