FoxA1及RNF6在宫颈鳞状细胞癌的表达及意义

常 畅，高 静，李志强，张 帅

(河北北方学院附属第二医院病理科，河北 张家口 075100)

宫颈癌是已婚妇女常见恶性肿瘤，2020年全球癌症统计系列报告显示全球新发宫颈癌人数占女性新发癌症总人数的6.5%，为影响妇女健康的第四位高发癌症[1-2]。宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是宫颈癌最常见的组织学类型，约占宫颈癌的80%～85%，多发于35岁以上女性人群，呈年轻化趋势[3-4]。早期CSCC可通过手术、放疗或化疗综合治疗治愈，晚期患者预后较差。叉头框蛋白A1(FOXA1)属于FOX家族成员，基因位于染色体14q21.1，FoxA 1作为转录辅助因子，由472个氨基酸构成，FoxA 1在多种组织中广泛表达，调节转录与DNA修复，在细胞生长、分化、胚胎发育、肿瘤发生发展及能量代谢等过程中发挥重要作用。RNF6基因定位于人染色体13q12.2，其编码的蛋白含有685个氨基酸，具有泛素连接酶活性。报道显示，RNF6异常表达与食管鳞状细胞癌、前列腺癌、胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病等疾病相关，为潜在的预后因素和治疗靶点[5-6]。我们探讨了FoxA1及RNF6在CSCC中的表达及意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析河北北方学院附属第二医院2014-04—2019-04月收治的164例CSCC患者(PE组)及164例慢性宫颈炎患者(对照组)的临床资料及保存良好的病理组织标本。PE组纳入标准：①均符合《WHO女性生殖器官肿瘤分类》CSCC相关诊断标准[7]；②术后病理学诊断均符合鳞状细胞癌。排除标准：①合并宫颈腺癌、小细胞癌等其他病理组织学类型；②合并全身其它系统鳞状细胞癌患者；③临床及随访资料不完整者。PE组患者年龄32～75岁，平均(54.25±24.13)岁；对照组患者年龄28～75岁，平均(52.83±26.37)岁。2组患者年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究经河北北方学院附属第二医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗人FoxA1单克隆抗体及兔抗人RNF6单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组织化学试剂盒及浓缩型二氨基联苯胺(diaminobendine，DAB)试剂盒均购自中杉金桥生物系统有限公司；TRIzol裂解液、反转录试剂盒及real time扩增试剂盒均购自Takara公司；PCR仪(型号：TIB-8300)购自泰普生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实时定量PCR技术检测FoxA1及RNF6 mRNA表达

按说明书提取保存完好的CSCC组织标本和慢性宫颈炎宫颈组织标本，总RNA反转录生成cDNA作为RT-qPCR扩增模板，PCR扩增条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s、40个循环，62 ℃ 1 min。引物序列：FoxA1上游引物为5′-GGAGCAACAGTGGTG-GAGTG-3′，下游引物为5′-GACGAAGGTCTGAGTA-CAGA-3′；RNF6上游引物为5′-AAGCGACAAC-CAGCTAGACTTTC-3′，下游引物为5′-TGGCGGAGT-GGACACAA-3′。记录每个标本的Ct值，采用实时定量PCR相对定量法分析，以2-△△Ct表示CSCC组织FoxA1及RNF6表达量相对于慢性宫颈炎宫颈组织表达量的变化倍数，其中△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，以△Ct作为校正得出△△Ct=△Ct(CSCC组织)-△Ct(慢性宫颈炎宫颈组织)。

1.3.2 免疫组织化学染色法检测FoxA1及RNF6蛋白表达水平

采用过氧化物酶标记链霉卵白素(streptvaidin-peroxidase，SP)免疫组织化学染色法，操作严格按照标准执行。通过轮转式切片机将组织标本蜡块切片，厚度3～5 μm，切片放置于56～60℃烤箱1～2 h。常规脱蜡水化：玻片浸入二甲苯10 min，重复操作3次，组织彻底脱蜡，然后将玻片浸入浓度依次为100%、95%、85%、70%递减的乙醇中水化，均浸泡5 min，最后将玻片浸入蒸馏水中5 min。放入pH8.0的EDTA中高压抗原修复2 min 30 s，3% H2O2处理10 min阻断内源性过氧化物酶，分别滴加FoxA1单克隆抗体(1∶100)、RNF6单克隆抗体(1∶100)，4 ℃冰箱过夜；PBS清洗3次后滴加抗小鼠/兔IgG过氧化物酶聚合物，37℃孵育30 min；洗涤后滴加新鲜配置DAB显色液室温显色10 min，最后行苏木素复染后放入乙醇梯度中脱水，二甲苯透明后进行中性树胶封片，显微镜观察并拍照。

1.4 判定标准

在显微镜下观察FoxA1及RNF6在CSCC及慢性宫颈炎宫颈组织中的染色情况，免疫组化染色结果判读标准：每张切片随机观察5个高倍视野，每个高倍视野计数阳性细胞数和细胞总数，采用半定量评分法评估蛋白表达情况，依据染色强度(不着色为阴性计0分；淡黄色为弱阳性计1分；浅棕色为中等阳性计2分；深棕色为强阳性计3分)和阳性细胞数量百分比(阴性计0分；1%～50%计1分；51%～74%计2分；大于75%计3分)的乘积确定最终得分：0分为阴性表达(-)；1～2分为弱表达(+)；3～4分为中度表达(2+)；6～9分为强表达(3+)[8]。

所有免疫组化玻片均由两位高级职称病理诊断医师在不知道切片的HE染色情况及组织诊断情况下独立审查并进行评分，最大程度避免人为干扰。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 CSCC及慢性宫颈炎宫颈组织FoxA1及RNF6蛋白表达水平比较

CSCC增殖的鳞状上皮侵入结缔组织内，形成许多互相连接的细胞巢、轮层状小体，细胞核增大、可见核分裂象，FOXA1及RNF6蛋白表达均定位于细胞质(图1)。PE组FoxA1及RNF6蛋白的表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

表1 2组FoxA1及RNF6蛋白表达比较

A：PE组HE组织形态；B：PE组FoxA1阳性表达；C：PE组RNF6阳性表达；D：对照组HE组织形态；E：对照组FoxA1阳性表达；F：对照组RNF6阳性表达

2.2 CSCC及慢性宫颈炎宫颈组织FoxA1及RNF6 mRNA表达水平比较

PE组FoxA1及RNF6 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。

表2 2组FoxA1及RNF6 mRNA表达比较

3 讨 论

有研究显示，CSCC发病率和死亡率在发达国家和发展中国家之间差异明显[9-12]。临床研究证实，浸润性CSCC的侵袭性与转移能力较强，死亡率达80%，肿瘤分化、侵袭和转移是导致肿瘤死亡率升高的重要原因，晚期CSCC复发率高，5年生存率仅40%～50%[13]。早期明确诊断，寻找靶向治疗的肿瘤生物标志物对CSCC具有重要临床意义。

FOXA是一种能够影响基因表达的调节因子，通过调节细胞周期与信号转导，在肿瘤发生发展中起重要作用，其家族有FOXA1、FOXA2及FOXA3 3个成员。FOXA1是FOXA家族中第一个被发现的，也是近年来学者们研究最多的FOXA成员，可通过参与调控肿瘤细胞增殖、迁移、细胞代谢、血管生成及上皮间质转化等过程参与肿瘤发生及恶性进展。食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等中都存在基因扩增及蛋白高表达，但其机制却各有差异[14]。已有研究证实，FOXA1基因位于人染色体14q21.1，它的N端的转录激活区域、中间的叉头框域及C端与组蛋白H3赖氨酸4相关的激活转录结合域3个区域，参与细胞上皮间质转化，在肿瘤侵袭起始阶段结合染色质后使其局部区域松解，该区G0/G1期细胞周期停滞，细胞增殖受到抑制[15-16]。RNF6是泛素-蛋白酶体系统中的一种E3泛素连接酶，基因长2 058 bp，编码包括C-端RING-H2指及N端螺旋结构域在内的685个氨基酸，通过调节Wnt/β-catenin、Akt/mTOR等通路、细胞凋亡过程中的caspases途径、磷酸化Ser/Thr进而抑制酪氨酸激酶活性磷酸化以及降解大部分短周期寿命蛋白的泛素-蛋白酶体系统在肿瘤中发挥重要作用[17]。RNF6通过泛素化降解TLE3蛋白、SHP-1蛋白等促进结直肠癌细胞增殖。RNF6还可稳定糖皮质激素受体、雌激素受体等，促进骨髓瘤及乳腺癌细胞增殖。RNF6还可参与STAT3等多条信号通路的调节，参与肿瘤转移、侵袭，影响放疗敏感性。

本研究通过PCR及免疫组化检测FOXA1在宫颈鳞状细胞癌中的表达，证实FOXA1在CSCC组织中表达水平明显高于慢性宫颈炎宫颈组织，提示FOXA1可能通过促进CSCC侵袭、迁移及增殖能力发挥作用。本研究结果还表明，RNF6在CSCC组织中表达水平明显高于慢性宫颈炎宫颈组织，其可能通过C-端RING-H2指结构活化丝氨酸激酶，进而被蛋白酶体降解，调节肿瘤细胞增殖及分化等生长过程。

综上，FoxA1、RNF6蛋白及mRNA在CSCC组织中表达水平明显高于慢性宫颈炎宫颈组织，FOXA1作为转录因子可通过调节宫颈鳞状细胞癌基因表达而增强侵袭能力，RNF6通过蛋白酶作用调节肿瘤细胞增殖、分化等生长过程，在CSCC发生发展中发挥重要作用。有待进一步研究二者在CSCC中的具体作用及机制，为临床治疗CSCC提供新路径。