ε-聚赖氨酸复配保鲜剂对蛋糕保鲜效果

张智恒，赵维武，孙海誉，孙秋慧，郭山，代舒同

山东元泰生物工程有限公司（日照 276800）

蛋糕是一种外来的焙烤食品，在发展过程中，不断地与国内的需求创新融合。它的消费已从特定场景，扩展至人民日常生活中。出品形式也逐渐小份化，满足零售的需求。蛋糕含蛋量高、营养丰富，口感绵软细腻、香味浓郁，深受消费者喜爱，渐渐发展为国人舌尖上的刚需[1]。但是蛋糕富含蛋白质和淀粉，水分含量高，易受微生物污染，造成霉斑和拉丝。蛋糕多数pH偏碱性，大多数化学保鲜剂保鲜效果差强人意[2]。鉴于蛋糕的食用频次及化学保鲜剂的体内残留风险，人们倾向于使用抑菌效率高、安全风险低的天然保鲜剂。在国内，ε-聚赖氨酸已被批准作为微生物源食品防腐剂使用，肉桂酸钾是食品香料型保鲜剂，迷迭香提取物是天然食品抗氧化剂和保鲜剂[3-5]。据报道，迷迭香提取物对黄曲霉、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌等细菌和真菌都有抑制效果[6-9]。也有研究表明，肉桂酸钾对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母等有抑制作用[10-11]。试验采用3种原料复配使用，运用响应面试验设计优化配比，以延长蛋糕保质期，为企业应用新型保鲜剂提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

ε-聚赖氨酸（山东元泰生物工程有限公司）；肉桂酸钾（武汉能迈科实业有限公司）；迷迭香提取物（河南中大恒源生物科技股份有限公司）；氯化钠（分析纯，佛山西陇化工有限公司）；平板计数琼脂、马铃薯葡萄糖肉汤（上海博微生物科技有限公司）；孟加拉红琼脂、营养肉汤、沙氏葡萄糖液体培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐肉汤（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）。

蛋糕制作原料：低筋面粉（五得利面粉集团有限公司）；白砂糖（云南滇鹏糖业有限公司）；泡打粉（北京古松经贸有限公司）；牛奶（郑州花花牛乳制品有限公司）；色拉油（益海嘉里食品营销有限公司）；抹茶粉（余姚绿谷工坊食品有限公司）；白醋、鸡蛋、食用盐（购于市场）。

1.2 仪器与设备

LDZF-50L-Ⅰ立式高压蒸汽灭菌器（山东申安医疗器械厂）；HH-4A数显恒温水浴锅[国华（常州）仪器制造有限公司]；BSM220分析天平（0.000 1 g，山东卓精电子科技有限公司）；JE3002电子天平（0.01 g，上海蒲春计量仪器有限公司）；MF-GFZ-136L鼓风干燥箱[迈福（山东）科学仪器股份有限公司]；LKB-204J烤箱（山东省博兴县凯凯厨房设备有限公司）；ZG-LZ908和面机（中山市灿欣电器制品有限公司）；BJPX-Ⅰ-250生化培养箱、BJPX-Ⅲ-250霉菌培养箱（山东博科科学仪器有限公司）；RE-205电动旋转蒸发仪（上海坎昆仪器设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 抹茶戚风蛋糕制作工艺流程

蛋清→加入适量白醋→低速搅打→加入白糖→快速搅打→蛋白糊

牛奶、色拉油→搅拌至无油花→加入低筋面粉、抹茶粉、泡打粉、盐→翻拌→加入蛋黄→搅拌→蛋黄糊→加入蛋白糊→调糊→注模→烘烤→冷却→脱模→成品

以蛋清140 g、蛋黄60 g、低筋面粉100 g、白砂糖80 g、泡打粉2 g、牛奶60 g、色拉油60 g、抹茶粉10 g、食用盐1 g、白醋0.2 mL的比例制作蛋糕。蛋糕的冷却、脱模、切分在无菌环境下进行，密闭包装，在37 ℃、Hr70%恒温恒湿培养箱中放置3 d[12]。

1.3.2 优势菌落的筛选

在无菌环境下称取10.0 g蛋糕，分别置于90 mL营养肉汤培养基和马铃薯葡萄糖肉汤培养基中。将营养肉汤置于37 ℃条件下振荡培养48 h后，无菌条件下在平板计数琼脂上划线分离，得多个单菌落，观察菌落形态、颜色、大小，并进行革兰染色。将马铃薯葡萄糖肉汤培养基置于28 ℃条件下振荡培养72 h后，无菌条件下在马铃薯葡萄糖琼脂上划线分离，得多个单菌落，观察菌落形态、颜色、大小[13]。

1.3.3 混合细菌、混合霉菌的制作

一般情况下，不添加任何保鲜剂的蛋糕，引起腐败的细菌和霉菌不止一种。为了尽可能还原蛋糕中的微生物生态环境，将分离的细菌、霉菌分别混合制成混合细菌、混合霉菌[14-15]。

将划线分离的各细菌单菌落用接种环接入营养肉汤，在37 ℃振荡培养48 h，用无菌生理盐水稀释成1.0×106～5.0×106CFU/mL，将各细菌悬浮液等体积混合，就制成混合细菌。

将划线分离的各霉菌单菌落用接种环挑取菌丝体或孢子接入沙氏葡萄糖液体培养基，在28 ℃振荡培养72 h，无菌环境下用4层灭菌纱布过滤，用无菌生理盐水稀释滤液，制成孢子浓度1.0×105～5.0×105CFU/mL的孢子悬液，然后将各霉菌孢子悬液等体积混合，就制成混合霉菌[16-17]。

1.3.4 最小抑菌浓度的测定

参照《消毒技术规范2002年版》中最小抑菌浓度测定试验（营养肉汤稀释法）、WS/T 411—2013《中华人民共和国卫生行业标准 抗丝状真菌药物敏感性试验 肉汤稀释法》中宏量肉汤稀释法操作步骤，测定ε-聚赖氨酸、迷迭香提取物、肉桂酸钾对混合细菌、混合霉菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。最终保鲜剂质量浓度分别为8.000，4.000，2.000，1.000，0.500，0.250，0.125，0.063，0.031和0.016 g/kg。

1.3.5 保鲜剂在蛋糕中的添加及响应面优化

由于3种保鲜剂都有较好的热稳定性，故可先与低筋面粉预混，根据工艺加入产品中[18]。制成的添加保鲜剂的成品蛋糕密闭包装，在37 ℃、Hr70%恒温恒湿培养箱中放置3 d后，按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》和GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》进行微生物检测。

根据3种保鲜剂测得的对混合细菌、混合霉菌的最小抑菌浓度，确定在蛋糕中的添加量。以ε-聚赖氨酸添加量、肉桂酸钾添加量、迷迭香提取物添加量为因素，运用响应面分析法（response surface methodology，RSM）原理，设计三因素五水平的中心组合设计（central composite design，CCD）试验，以微生物总数（蛋糕37 ℃、Hr70%放置3 d的菌落总数和霉菌总数之和）为响应值，优化各保鲜剂添加量。

1.3.6 产品验证及其他指标检测

对最优的3种保鲜剂的添加量进行验证试验，并且根据GB 7099—2015《食品安全国家标准 糕点、面包》检测产品的酸价、过氧化值。

2 结果与分析

2.1 优势菌落的分离纯化结果

2.1.1 优势细菌的分离纯化结果

通过对腐败蛋糕中的微生物的培养、分离、纯化，得到2种细菌，菌落形态及革兰染色观察结果见表1。

表1 菌落形态及革兰染色观察结果

2.1.2 优势霉菌的分离纯化结果

通过对腐败蛋糕中的微生物的培养、分离、纯化，得到2种霉菌，菌落形态观察结果见表2。

表2 菌落形态及显微镜观察结果

2.2 最小抑菌浓度测定结果

由表3可知，ε-聚赖氨酸对引起蛋糕腐败的微生物抑菌能力最强，其次是肉桂酸钾，迷迭香提取物弱于二者。由于霉菌不同于细菌的细胞结构，以及3种保鲜剂对两者抑菌机理的差异，3种保鲜剂对混合霉菌的MIC值均高于混合细菌。ε-聚赖氨酸抑制细菌的主要原理是细胞膜的损伤和ROS（活性氧）升高引起的细胞死亡；抑制霉菌的主要原理是创伤菌丝体和促进孢子产生过多ROS，从而抑制孢子萌发和造成菌丝体创伤性空腔[19-23]。肉桂酸钾和迷迭香提取物抑制细菌的原理则是有效成分直接作用于细胞壁和细胞膜，造成胞内成分泄漏；抑制霉菌的原理是损伤菌丝骨架，造成细胞间隔解体，表面扭曲[24-30]。

表3 3种保鲜剂对混合细菌、混合霉菌MIC值单位：g/kg

2.3 响应面法优化

2.3.1 试验因素及水平

根据3种保鲜剂对混合细菌、混合霉菌的MIC值，以混合霉菌的MIC值为基准质量浓度，用其值的7.95%，25.00%，50.00%，75.00%和92.05%为各因素的水平，设置响应面的三因素五水平表，见表4[31]。

表4 响应面分析法的因素和水平表 单位：g/kg

2.3.2 响应面设计及试验结果分析

通过Design Expert 10软件对CCD试验进行设计，试验结果如表5所示。分析试验数据得到回归方程模型：R=1 203.60-153.40A+64.50B-178.13C+183.75AB+148.75AC+236.25BC+242.81A2+202.15B2+35.98C2。

表5 CCD试验设计与结果

对数据进行二次多元回归拟合分析，得到回归方程的方差分析和系数估计值，如表6所示。响应面模型的相关系数R2=0.981 4，模型回归效果极显著（P＜0.01）；失拟项没有显著性（P＞0.05），说明该回归方程模拟的三因素五水平分析可靠；模型的相关系数R2=0.981 4，矫正决定系数Radj2=0.964 6，说明自变量的选择是合适的，模型能够较准确描述试验结果，可进行下一步的研究分析。

表6 回归方程的方差分析

根据表6可知：A、C的P＜0.01，B的P＜0.05，说明ε-聚赖氨酸添加量、迷迭香提取物添加量对蛋糕的微生物总数影响极为显著，肉桂酸钾添加量对蛋糕的微生物总数影响为显著，ε-聚赖氨酸添加量、迷迭香提取物添加量对蛋糕的微生物总数影响力比肉桂酸钾添加量大。AB、AC、BC的P值均小于0.01，说明ε-聚赖氨酸添加量、迷迭香提取物添加量、肉桂酸钾添加量三者中的任意两者之间的交互作用对蛋糕的微生物总数影响都是极为显著的。

图1～图3反映了各个因素之间的交互作用对蛋糕的微生物总数的影响，响应面整体呈现中心凹陷的形状，并且等高线呈现椭圆形，表明A、B、C三因素中两两之间的交互作用对蛋糕的微生物总数的影响极具显著性。由图1可知：固定迷迭香提取物添加量，当肉桂酸钾处于较低添加量时，随着ε-聚赖氨酸添加量的增加，微生物总数先大幅降低后处于平缓状态；当肉桂酸钾处于较高添加量时，随着ε-聚赖氨酸添加量的增加，微生物总数先大幅降低后升高。3种保鲜剂作用于细菌的部位和原理既有相同（都结合细胞膜，造成膜损伤），又有不同（胞内物质结合不同）。某种保鲜剂添加量较高时，就会造成另外2种保鲜剂与细菌接触的几率降低，不能较好发挥协同作用。

图1 ε-聚赖氨酸与肉桂酸钾的交互作用

图2 ε-聚赖氨酸与迷迭香提取物的交互作用

图3 肉桂酸钾与迷迭香提取物的交互作用

2.3.3 各个因素最佳水平的确定

通过Design Expert 10软件处理数据，得到各个因素的最佳水平，即ε-聚赖氨酸添加量0.147 g/kg，肉桂酸钾添加量0.137 g/kg，迷迭香提取物添加量0.750 g/kg，此时蛋糕的微生物总数（细菌霉菌总数之和）最小，为920 CFU/g。

2.3.4 产品验证及其他指标检测

按照上述最佳水平进行3次平行试验，置于37 ℃、Hr70%恒温恒湿培养箱3 d后，霉菌、大肠菌群未检出，细菌菌落总数平均值为950 CFU/g，接近预测值；继续加速，到第6天，霉菌总数平均值为138 CFU/g，大肠菌群未检出，细菌菌落总数平均值为3.4×104CFU/g，接近变质。同时做的空白对照组，第3天时，霉菌总数平均值达到320 CFU/g，大肠菌群未检出，细菌菌落总数平均值已达5.0×104CFU/g，已不符合GB 7099—2015《食品安全国家标准 糕点、面包》要求。

迷迭香具有抗油脂氧化的作用。测定添加复配组蛋糕和空白对照组蛋糕的酸价和过氧化值。复配组酸价平均值为0.88 mg/g，空白对照组酸价平均值为1.46 mg/g；复配组过氧化值平均值为0.05 g/100 g，空白对照组过氧化值平均值为0.08 g/100 g。加入复配保鲜剂之后，蛋糕的酸价和过氧化值都会显著降低。

3 结论

以新型保鲜剂ε-聚赖氨酸、肉桂酸钾、迷迭香提取物为原料，通过最小抑菌浓度试验和响应面试验，得出3种保鲜剂最佳添加量：ε-聚赖氨酸0.147 g/kg，肉桂酸钾0.137 g/kg，迷迭香提取物0.750 g/kg，并经过验证，复配保鲜剂可显著延长抹茶戚风蛋糕保质期。试验旨在为新型保鲜剂在糕点中的应用提供理论支持，肉桂酸钾、迷迭香提取物自身带有一定味道，后续将联合两者的生产厂家开发出专用的保鲜型肉桂酸钾和迷迭香提取物。