硫磺菌乙酸乙酯提取物抗氧化活性及其成分分析

朱新婷，李欣悦，余雪颖，陈永澎，高逸萱，魏奇

1.宁德师范学院海洋学院（宁德 352100）；2.福建省科技厅产学研合作示范基地（宁德 352100）；3.闽东特色生物资源福建省高校工程研究中心（宁德 352100）

硫磺菌（Laetiporus sulphureus），又名硫磺多孔菌，是我国一种食药兼用的大型真菌，含有丰富的营养物质，如蛋白质、脂质、维生素、矿物质、人体多种必需氨基酸等[1]。硫磺菌具有抗氧化、抗癌和抑菌等功效[2-3]。王娟等[4]研究发现，包括硫磺菌在内的高等真菌含有多糖、酚类、黄酮、萜类等活性物质，并且这些物质均具有很强的生理活性。闫梅霞等[5]研究表明，硫磺菌粗多糖低、中、高剂量组均能在一定程度上抑制Lewis肺癌实体瘤，说明硫磺菌粗多糖具有抗癌的作用，并可有效保护小鼠的胸腺和脏器，在一定程度上可提高小鼠的免疫力并促进其健康生长。胡亚平等[6]研究表明，硫磺菌多糖在体外有一定的自由基清除能力，还能抑制BGC细胞的增殖，具有抗胃癌及抗氧化的能力。同时，权琳等[7]研究发现，硫磺菌子实体中含有的生物碱类化合物能显著抑制小麦赤霉病菌与马铃薯干腐病菌，可有效避免使用多菌灵、百菌清等化学药剂，从而减少化学农药残留和环境污染。有研究表明，由抗氧化剂失衡和自由基所引起的氧化应激参与糖尿病的发展，因此抗氧化剂在治疗1型和2型糖尿病具有较好前景[8]。将硫磺菌的提取物作为一种天然的无公害生物活性剂进一步开发利用，具有十分广阔的前景。

以硫磺菌为原料，制备硫磺菌乙酸乙酯提取物，测定提取物的多糖、多酚、黄酮和三萜含量并评估其体外抗氧化活性，旨在为硫磺菌乙酸乙酯提取物在饲料、食品、药品的实际生产中的应用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

硫磺菌，由宁德师范学院海洋学院生物活性物质研究实验室提供。

ABTS[2,2-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵盐]、DPPH（1,1-二苯基苦基苯肼）、Trolox（水溶性维生素E），均购于北京索莱宝科技有限公司。

水杨酸、芦丁、氯乙酸、氯化铁、香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、过硫酸钾、硫酸亚铁、过氧化氢、铁氰化钾、邻苯三酚、没食子酸、齐墩果酸、磷酸钠缓冲液、苯酚、浓硫酸、福林酚、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、Tris-HCl（pH 8.2，0.05 mol/L）、氯化氢，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

MS 3 basic振荡器（德国IKA公司）；YT2204精密电子天平（苏州正峰电子科技有限公司）；LC-RE-2000A旋转蒸发器（湖南力辰仪器科技有限公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）；DF-101S电热恒温水浴锅（上海析牛莱伯仪器有限公司）；L550台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Unique-S20多功能超纯水系统（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）；DHG-9070A鼓风干燥箱（上海飞越实验仪器有限公司）；Feyond-A300酶联免疫分析仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 硫磺菌乙酸乙酯提取物的制备

称取100 g硫磺菌粉，按料液比1∶10 g/mL加入乙酸乙酯，置于水浴锅中80 ℃提取3 h，过滤去除残渣。滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩液经过冷冻干燥机处理后，得到硫磺菌乙酸乙酯提取物，置于-25 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 硫磺菌乙酸乙酯提取物对DPPH自由基的清除作用

参照陈晓宁等[9]的方法测定不同浓度梯度硫磺菌乙酸乙酯提取物（62.50，125.00，250.00，500.00和1 000.00 mg/mL）对DPPH自由基的清除率。根据式（1）计算DPPH自由基清除率。

式中：A1为样品与DPPH反应的吸光度；A2为无水乙醇代替DPPH的吸光度；A0为无水乙醇代替样品的吸光度。

1.2.3 硫磺菌乙酸乙酯提取物对ABTS自由基的清除作用

参照孟庆焕等[10]的方法测定不同浓度梯度的硫磺菌乙酸乙酯提取物（31.25，62.50，125.00，250.00和500.00 mg/mL）对ABTS自由基清除率。计算同式（1）。式中：A1为样品与ABTS反应的吸光度；A2为蒸馏水代替ABTS的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.4 硫磺菌乙酸乙酯提取物对羟自由基的清除作用

参考张倩等[8]的试验方法测定硫磺菌乙酸乙酯提取物（1.00，2.00，4.00，8.00和10.00 mg/mL）清除羟自由基能力。计算同式（1）。式中：A1为样品组的吸光度；A2为蒸馏水代替H2O2的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.5 硫磺菌乙酸乙酯提取物还原能力的测定

参考张晨[11]的方法测定不同浓度梯度硫磺菌乙酸乙酯提取物（0.31，0.63，1.25，2.50和5.00 mg/mL）的还原力。根据式（2）计算还原力。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为对照组的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.6 硫磺菌乙酸乙酯提取物对超氧阴离子自由基清除能力的测定

参考廖圆圆等[12]的方法测定不同浓度梯度的硫磺菌乙酸乙酯提取物（0.50，1.00，2.00，4.00和8.00 mg/mL）对超氧阴离子自由基的清除率。计算同式（1）。式中：A1为样品组的吸光度；A2为蒸馏水代替邻苯三酚的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.7 硫磺菌乙酸乙酯提取物中多糖的测定

参考王银平[13]的方法测定硫磺菌乙酸乙酯提取物中多糖含量。分别取样品溶液（0.5 mL）、蒸馏水（1.5 mL）、苯酚溶液（1 mL，5%）和浓硫酸（5 mL），混匀后，测定其在490 nm波长处的吸光度。

1.2.8 硫磺菌乙酸乙酯提取物中多酚的测定

参考魏奇[14]的方法测定硫磺菌乙酸乙酯提取物中多酚含量。将200 μL的样品溶液、200 μL的福林酚和800 μL的蒸馏水混匀，然后避光静置6 min。再加入2 mL的Na2CO3溶液（7%）和1.6 mL的蒸馏水，混匀后避光静置90 min。测定其在760 nm波长处的吸光度。

1.2.9 硫磺菌乙酸乙酯提取物中黄酮的测定

参考张少岩等[15]的方法测定硫磺菌乙酸乙酯提取物中黄酮含量。将300 μL NaNO2溶液（5%）和5 mL样品溶液混匀，然后静置6 min，加入300 μL Al(NO3)3（10%）混匀，然后静置6 min，再加入4.4 mL NaOH（4%）混匀，然后静置12 min。测定其在510 nm波长处的吸光度。

1.2.10 硫磺菌乙酸乙酯提取物中三萜的测定

参考刘奇等[16]的方法测定硫磺菌乙酸乙酯提取物中三萜含量。将0.5 mL的样品溶液于90 ℃挥干，冷却后加入0.25 mL香草醛-醋酸溶液（5%）、1.5 mL高氯酸和0.4 mL蒸馏水，于60 ℃水浴15 min，再加入2.5 mL冰醋酸混匀，测定其在540 nm波长处的吸光度。

1.3 数据统计与分析

数据采用Excel统计收集，采用SPSS 20软件进行显著性分析，不同字母表示显著性差异（P＜0.05）。取3次重复试验的平均值。

2 结果与分析

2.1 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的测定

如图1所示，在62.50～1 000 μg/mL的质量浓度范围内，水溶性维生素E能将DPPH自由基全部清除。随着硫磺菌乙酸乙酯提取物质量浓度的增加，其对DPPH自由基清除率也随之增加。质量浓度62.50 μg/mL时，硫磺菌乙酸乙酯提取物对DPPH清除率在测定范围内最低，为3.68%±1.23%，硫磺菌乙酸乙酯提取物浓度1 000 μg/mL时，清除率在测定范围内最高，为81.35%±0.86%。在相同质量浓度下，硫磺菌乙酸乙酯提取物对DPPH自由基的清除作用小于水溶性维生素E的。硫磺菌乙酸乙酯提取物的DPPH自由基清除率EC50值为604.03 μg/mL。

图1 硫磺菌乙酸乙酯提取物对DPPH自由基的清除能力

2.2 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除ABTS自由基的测定

由图2可知，质量浓度31.25 μg/mL时，水溶性维生素E已将ABTS自由基全部清除。在31.25～500 μg/mL质量浓度范围内，ABTS自由基清除率随着硫磺菌乙酸乙酯提取物浓度升高而升高。硫磺菌乙酸乙酯提取物质量浓度31.25 μg/mL时，硫磺菌乙酸乙酯提取物清除ABTS自由基的清除率最小，为24.21%±2.41%。硫磺菌乙酸乙酯提取物质量浓度500 μg/mL时，硫磺菌乙酸乙酯提取物清除ABTS自由基清除率最大，为84.78%±1.21%。在相同质量浓度下，硫磺菌乙酸乙酯提取物对ABTS自由基的清除作用小于水溶性维生素E的。硫磺菌乙酸乙酯提取物的ABTS自由基清除率EC50值为204.96 μg/mL。

图2 硫磺菌乙酸乙酯提取物对ABTS自由基的清除能力

2.3 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除羟自由基的测定

由图3可知，在1～8 mg/mL质量浓度内，水溶性维生素E和硫磺菌乙酸乙酯提取物对羟自由基清除能力随着其质量浓度的增加而增强。8 mg/mL的水溶性维生素E清除羟自由基的作用与10 mg/mL的没有显著差异（P＞0.05）。质量浓度1 mg/mL时，硫磺菌乙酸乙酯提取物对羟自由基的清除率达最小值（11.55%±2.45%）。硫磺菌乙酸乙酯提取物质量浓度为10 mg/mL时，其对羟自由基清除率达最大值（67.98%±4.71%）。硫磺菌乙酸乙酯提取物的羟自由基清除率EC50值为6.95 mg/mL。

图3 硫磺菌乙酸乙酯提取物对羟自由基的清除能力

2.4 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除超氧阴离子的测定

如图4所示，在0.50～8.00 mg/mL质量浓度内，水溶性维生素E和硫磺菌乙酸乙酯提取物对超氧阴离子自由基清除率随其质量浓度增加而增强。硫磺菌乙酸乙酯提取物质量浓度0.50 mg/L时，其对超氧阴离子自由基清除率达最小值（13.65%±2.53%）。质量浓度为8 mg/L时，其对超氧阴离子自由基清除率达最大值（43.60%±1.62%）。硫磺菌乙酸乙酯提取物的羟自由基清除率EC50值为9.47 mg/mL。在硫磺菌乙酸乙酯提取物质量浓度与水溶性维生素E质量浓度相同情况下，水溶性维生素E清除率优于硫磺菌乙酸乙酯提取物清除率。

图4 硫磺菌乙酸乙酯提取物对超氧阴离子的清除作用

2.5 硫磺菌乙酸乙酯提取物还原能力的测定

如图5所示，在0.31～5.00 mg/mL范围内，硫磺菌乙酸乙酯提取物与水溶性维生素E的还原能力随着质量浓度的升高而增强。在相同质量浓度下，硫磺菌乙酸乙酯提取物的还原能力小于水溶性维生素E的还原能力。

图5 硫磺菌乙酸乙酯提取物的还原能力

2.6 硫磺菌乙酸乙酯提取物的活性物质含量分析

由表1可知，在硫磺菌乙酸乙酯提取物中，多糖、多酚、黄酮、三萜的含量分别为76.27±3.29，19.15±0.66，9.12±0.41和32.41±4.03 mg/g。其中，多糖含量占比最高（76.27±3.29 mg/g），黄酮含量最低（9.12±0.41 mg/g）。

表1 硫磺菌乙酸乙酯提取物中活性物质含量

3 结论

试验以水溶性维生素E作为阳性对照，研究硫磺菌乙酸乙酯提取物对DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除作用及其还原能力。结果表明，硫磺菌乙酸乙酯提取物对4种自由基清除能力的EC50分别为604.03 μg/mL，204.96 μg/mL，6.95 mg/mL和9.47 mg/mL。张景等[17]研究发现，羊肚菌多糖具有清除羟自由基和DPPH自由基的作用。由此可知，食用菌具有清除自由基作用。硫磺菌乙酸乙酯提取物中多糖、多酚、黄酮、三萜的含量分别为76.27±3.29，19.15±0.66，9.12±0.41和32.41±4.03 mg/g。试验表明，硫磺菌乙酸乙酯提取物具有一定的抗氧化能力与营养价值，为后续研究开发天然来源的抗氧化产品奠定理论基础。