IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

张晓战，董轩志，吕楠楠，刘懿雯，马新甜，王林青，夏艳勋，蒋增海，郭运泽，赵攀登，宋予震，杨德成，边传周

IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

1河南牧业经济学院动物医药学院，郑州 450046；2郑州师范学院/分子生物学郑州市重点实验室, 郑州 450044；3中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室，哈尔滨 150069

【背景】塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区（untranslated region, UTR）中的内部核糖体进入位点（IRES）元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株，在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响，为进一步了解SVA致病机制奠定基础。 【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础，通过定点突变的方式，逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基（ACTCAAGCG）替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基（CACGCCTGCCGATAGACGATT），构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后，利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定，同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞，盲传至P2代，获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定，P5代病毒基因组序列未发生碱基突变，P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2，及仓鼠源细胞系BHK-21，进行细胞感染试验，结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变，表现出相似的生长曲线趋势，表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性；但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异，rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差，诱使细胞病变的时间较晚，在感染24 hpi，两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株，确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响，有助于我们更好地了解SVA致病机制，拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。

塞内卡病毒；内部核糖体进入位点；反向遗传操作系统；病毒复制；细胞嗜性

0 引言

【研究意义】猪塞内卡病毒病是由塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）感染引起的一种新发、急性、水疱性传染病，临床症状主要表现为猪特发性水疱病（swine idiopathic vesicular disease , SIVD）和新生仔猪急性死亡[1-2]。该病首次在美国和加拿大等地暴发，随后蔓延至巴西、泰国、中国等多个国家，给世界养猪业造成了严重的经济损失[3-4]。SVA基因组为单股正链RNA，属于小RNA病毒科（）塞内卡病毒属（）。该病毒基因组全长约7.3 kb，包含一个开放阅读框，编码由2 181个氨基酸组成的多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体在宿主和病毒蛋白酶的共同作用下裂解为12个成熟的病毒蛋白，包括4个结构蛋白（VP4、VP2、VP3和VP1）和8个非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）[5]。【前人研究进展】SVA 基因组两侧分别为5′和3′非编码区（untranslated region, UTR），5′UTR区域包含668个核苷酸，含有IV型核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES），在病毒mRNA翻译过程中能够弥补其无帽子结构的不足，确保病毒感染过程中翻译的启动[6]；SVA 3′UTR区域包含98个核苷酸，其中末端为长约30个核苷酸的poly（A）尾巴，该区域序列可折叠为两个茎环，形成类似“吻式”发夹结构，在病毒基因组RNA复制过程中发挥一定的作用[7-8]。小核糖核酸病毒基因组RNA缺乏帽子结构，通过IRES依赖性翻译过程启动病毒蛋白的翻译过程，IRES功能的发挥是确保小核糖核酸病毒感染的重要因素[9-10]。SVA的IRES结构和功能与丙型肝炎病毒和猪瘟病毒的IRES类似，含有4个结构域（domain），其中Domain II/III含有复杂的茎环结构和假结结构，能够与核不均一核糖蛋白Q（hnRNP Q）、核不均一核糖蛋白L（hnRNP L）、多聚嘧啶区结合蛋白1（PTBP1）多种IRES反式作用因子（IRES- transactivating factors, ITAFs）作用，招募40S核糖体亚基和真核翻译起始因子，启动翻译过程[8, 11]。IRES结构域中RNA序列的改变，能够影响病毒的复制、组织嗜性、感染谱或致病性[9]。【本研究切入点】2017年，我国广东地区猪群中出现了IRES Domain II区域308—317 nt的9个碱基（）被21个碱基（）置换的自然突变SVA毒株，临床观察突变株对猪的致病性显著降低[12]，然而该区域碱基的突变与病毒复制及细胞嗜性间的关系尚不清楚。【拟解决的关键问题】为鉴定该IRES Domain II区域的自然突变是否影响病毒的体外复制能力和细胞嗜性，本研究通过定点突变的方式，将SVA毒株HeN-1/2018基因组IRES核心区域Domain II 308—317 nt的9个碱基（）替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基（），成功构建pHeN- 1/2018-i12载体。随后转染细胞拯救病毒，获得IRES Domain II区域突变株rHeN-1/2018-i12，并进一步通过病毒感染试验评估突变病毒与亲本毒在不同细胞中生长特性。

1 材料与方法

本研究中涉及的质粒构建、病毒拯救及鉴定和病毒感染试验于 2020—2023 年在河南牧业经济学院河南省猪病防控工程技术研究中心完成。部分细胞感染试验在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所完成。

1.1 细胞与病毒

猪肾细胞系PK-15、IBRS-2和仓鼠肾成纤维细胞系BHK-21由河南省猪病工程中心实验室保存。SVA流行毒株HeN-1/2018分离自2018年河南地区发病猪群[13]，基于该毒株基因组构建的重组毒株rHeN-1/ 2018由河南省猪病工程中心实验室拯救[14]。各细胞生长液为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg·mL-1链霉素的高糖DMEM培养基，置于37℃含5% CO2培养箱中培养。病毒生长所需细胞维持液为含2%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg ·mL-1链霉素的高糖DMEM培养基。

1.2 质粒与主要试剂

含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/ 2018由河南省猪病工程中心实验室构建及保存[14]，兔抗SVA VP2蛋白多克隆抗体由该实验室保存。高糖DMEM培养基、opti-MEM培养基及0.25%-EDTA胰酶购自Gibco公司；RNA抽提试剂TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化生物公司；高保真DNA聚合酶和反转录试剂盒购自TOYOBO东洋纺生物公司；T7体外转录试剂盒Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit购自Thermo公司；DpnI内切酶、Lipo6000™转染试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、FITC标记的羊抗兔IgG (H+L)抗体和HRP标记羊抗兔IgG(H+L)抗体购自碧云天生物公司；HRP标记GAPDH单克隆抗体购自武汉三鹰生物公司；胎牛血清购自四季青天杭生物公司；细胞培养板及细胞培养瓶购自NEST公司。

1.3 病毒IRES突变区域基因组和RNA结构分析

通过小RNA病毒专业数据库（https://www. picornaviridae.com/）和NCBI数据库检索下载SVA代表毒株序列，将所分析毒株的基因组序列提交Clustal Omega进行在线比对[15]，分析比对不同SVA毒株5′UTR区域IRES序列之间的相似性。随后，利用RNAfold软件分析HeN-1/2018和IRES突变株GD04/ 2017株的IRES核心区域病毒RNA二级结构，评估在最低自由能情况下IRES Domain II区域突变前后RNA的二级结构变化情况。

1.4 IRES突变病毒的构建与拯救

1.4.1 pHeN-1/2018-i12感染性克隆载体的构建 以前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础，通过多点突变的方式，逐步将其IRES核心区域Domain II 308—317 nt的9个碱基（）替换为GD04/2017株基因组308— 328 nt的21个碱基（），获得重组质粒pHeN-1/2018-i12。具体步骤如下，利用IRESmut-1 F/IRESmut-1 R引物对（表1），以载体pHeN-1/2018为模板进行PCR，PCR产物进行DpnI限制性内切酶37℃消化4 h后转化DH10B感受态细胞，挑取单菌落进行摇菌，通过菌液PCR鉴定阳性克隆，测序正确的菌液提取质粒，获得重组载体pIRESmut-1。随后按照上述步骤，依次通过IRESmut-2 F/IRESmut-2 R、IRESmut-3 F/IRESmut-3 R和IRESmut-4 F/IRESmut-4 R引物对（表1），将剩余的碱基进行突变置换，获得重组载体pHeN-1/2018- i12。

表1 引物信息

1.4.2 IRES突变病毒的体外拯救 参照文献[16]的方法拯救SVA重组病毒。提前一天铺BHK-21细胞于24孔细胞培养板，待其汇合度至85%左右，更换细胞培养液为不加抗生素的opti-MEM培养基。在opti-MEM溶液背景下，将1 μL转染试剂Lipo6000TM与500 ng重组质粒pHeN-1/2018-i12混合均匀，室温孵育10 min，随后转染入状态良好的BHK-21细胞。转染后5 h更换细胞培养液，间隔12 h观察细胞病变情况。继续培养3 d后冻融细胞，离心收取上清，即为重组毒rHeN-1/2018-i12 P0代。随后接种PK-15细胞，盲传至出现明显细胞病变，观察记录细胞病变情况和病毒传代次数，获得重组毒rHeN-1/2018-i12。

1.4.3 病毒间接免疫荧光鉴定 铺PK-15细胞于48孔细胞培养板，待其汇合度达到80%时，按照病毒感染复数MOI为0.1的接种剂量，分别接种SVA亲本株rHeN-1/2018和IRES突变株的病毒rHeN-1/ 2018-i12，同时设置未接毒细胞组。37℃孵育1 h后PBS洗涤2次，添加细胞维持液继续培养。在24 hpi吸弃细胞上清，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，随后用0.5% Triton X-100室温处理30 min透化细胞膜。细胞洗涤3次后用1﹕200稀释的兔抗SVA-VP2多克隆抗体处理1 h，随后用1﹕500稀释的FITC标记的羊抗兔IgG处理1 h。最后细胞用PBS洗涤4次后用1 μmol·L-1DAPI处理10 min染核，用EVOS FL 细胞成像系统观察荧光情况。

1.4.4 病毒蛋白Western blot鉴定 将SVA亲本株rHeN-1/2018和IRES Domain II区域突变株的病毒rHeN-1/2018-i12感染PK-15细胞，24 hpi吸弃细胞上清，收集细胞样品，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组样品蛋白浓度。各组样品处理后取等量进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2 h。分别用1﹕1000稀释的兔抗SVA-VP2多克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜，洗涤3次后用1﹕5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG室温孵育1 h。TBST缓冲液洗涤3次后用ECL显色试剂盒处理显色分析。各组样品同时利用HRP标记GAPDH单克隆抗体孵育及显色，分析各组样品中内参蛋白GAPDH的表达情况。

1.5 IRES突变对病毒生长特性的影响

1.5.1 病毒滴度的测定 铺PK-15细胞于96孔细胞培养板，每孔150 μL，培养过夜；取SVA亲本株rHeN-1/2018或IRES突变株的病毒rHeN-1/2018-i12细胞培养物用细胞维持液进行10倍倍比稀释，稀释度从10-1到10-10；将96孔细胞培养板中细胞培养基吸弃，用无菌PBS洗涤PK-15细胞2次，加入细胞维持液，100 μL/孔；然后加入各个稀释度的病毒稀释液，100 μL/孔，每个稀释度做8个重复，同时设置未接种病毒阴性对照组；处理后细胞放置于37℃、5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录各孔细胞病变情况。按照Reed-Muench氏法来计算各SVA病毒株病毒滴度TCID50。

1.5.2 IRES突变病毒的遗传稳定性评价 将拯救病毒rHeN-1/2018-i12与亲本株病毒rHeN-1/2018分别按照0.1 MOI接种PK-15细胞，连续传代10次。取SVA亲本株rHeN-1/2018和IRES Domain II区域突变株的病毒rHeN-1/2018-i12 P5代和P10代病毒培养物，利用Trizol法提取SVA毒株病毒培养物的病毒RNA，反转录为cDNA，利用高保真酶PrimeSTAR HS进行扩增SVA病毒全基因组序列，测序分析，鉴定亲本毒株和重组毒株的遗传稳定性。

1.5.3 IRES突变病毒在不同细胞上的生长曲线 分别将猪肾细胞系PK-15、IBRS-2和仓鼠肾成纤维细胞系BHK-21铺于24孔细胞培养板，待其汇合度至85%时，按照病毒感染复数MOI为0.1的接种剂量，分别接种SVA亲本株rHeN-1/2018和IRES Domain II区域突变株的病毒rHeN-1/2018-i12。37℃孵育1h后更换细胞维持液培养。在病毒接种后的12、24、36和48 h收取细胞样品。各毒株每个时间点设置3个重复。随后测定病毒滴度TCID50，绘制病毒的生长曲线。

2 结果

2.1 SVA毒株IRES突变区域结构分析

通过对比GD04/2017株和其他分支SVA毒株基因组5′UTR区域序列，发现GD04/2017株IRES元件存在独特突变：即经典SVA毒株IRES 308—317位的9个碱基（）被置换成了21个碱基（）（图1-A）。RNA结构预测分析显示，GD04/2017株所具有的非连续插入基因片段使IRES Domain IIa区茎环结构明显改变（图1-B）。

图1 不同SVA毒株IRES核心区序列比对（A）及RNA二级结构分析（B）

2.2 IRES突变病毒的拯救

将重组载体pHeN-1/2018-i12转染BHK-21细胞，转染后48 h时无明显的细胞病变现象。盲传至P2代时，感染PK-15细胞48 h，部分细胞开始出现病变，72 hpi 80%细胞病变明显，出现细胞变圆、皱缩、脱落现象，收获病毒液，获得重组毒株rHeN-1/ 2018-i12。自P2代以后，IRES突变株rHeN-1/2018- i12感染PK-15细胞病变时间趋于稳定，在感染后48 h可以导致感染细胞出现明显细胞病变。随后用P3代的rHeN-1/2018-i12接种PK-15细胞，测定其病毒滴度为105.31TCID50/0.1mL。

将MOI为0.1的亲本株病毒rHeN-1/2018和突变株病毒rHeN-1/2018-i12分别感染PK-15细胞，观察细胞病变情况。结果表明亲本株rHeN-1/ 2018在24 hpi细胞开始出现细胞病变，40 hpi 90%细胞出现病变；而IRES Domain II区域突变株rHeN-1/2018-i12 感染组细胞病变出现较晚，在感染30 hpi细胞开始出现细胞病变，40 hpi 60%— 70%细胞出现病变，48 hpi 90%细胞出现病变（图2）。

图2 不同SVA毒株感染PK-15细胞试验

2.3 IRES突变病毒的鉴定

通过间接免疫荧光试验和Western blot试验证实所拯救病毒为SVA毒株，分别将亲本株病毒rHeN-1/ 2018和突变株病毒rHeN-1/2018-i12感染PK15细胞，24 hpi后固定细胞后通过抗SVA-VP2多克隆抗体进行间接免疫荧光试验，分析感染细胞内VP2蛋白的存在情况。结果显示rHeN-1/2018和rHeN-1/2018-i12感染组细胞内均发现特异性亮绿色荧光，而未感染细胞组没有观察到荧光细胞（图3），说明rHeN-1/2018和rHeN-1/2018-i12病毒培养物中存在SVA病毒。此外，对比不同感染组含绿色荧光细胞数发现，rHeN-1/2018感染组含绿色荧光细胞数明显多于rHeN-1/2018-i12感染组，表明在24 hpi时rHeN-1/2018感染组内的病毒含量高于rHeN-1/2018-i12感染组。此外，Western blot试验进一步证实了亲本株病毒rHeN-1/2018和突变株病毒rHeN-1/2018-i12的VP2结构蛋白能够在感染细胞内表达，且rHeN-1/2018感染组的VP2蛋白表达量要明显高于rHeN-1/2018-i12感染组（图4）。

图3 不同SVA毒株的间接免疫荧光试验

2.4 IRES突变病毒的遗传稳定性

为确定IRES突变株病毒是否具有良好的遗传稳定性，将亲本株病毒rHeN-1/2018和突变株病毒rHeN- 1/2018-i12连续在PK-15细胞传代10次，分析其病毒基因组稳定性。针对病毒基因组和5’UTR区域分别设计引物进行克隆测序，RT-PCR试验证实各代次rHeN-1/2018和rHeN-1/2018-i12均能够扩增出条带单一，大小正确的目的条带（图5-A）。此外，对P5代和P10代亲本株病毒rHeN-1/2018和突变株病毒rHeN-1/2018-i12进行全基因组测序分析，P5代的rHeN-1/2018和rHeN-1/2018-i12没有出现基因组变异的情况（图5-B），P10代次的rHeN-1/2018-i12毒株在2C基因区域C4260T突变，为同义突变。

图4 不同SVA毒株感染过程中VP2蛋白的Western blot鉴定

2.5 IRES突变病毒在不同细胞中复制能力显著低于亲本病毒

为验证IRES突变病毒与亲本株之间在细胞嗜性及生长特性的差异，分别将P3代次的亲本株病毒rHeN-1/2018和IRES Domain II区域突变株病毒rHeN-1/2018-i12感染PK-15、IBRS-2和BHK-21等细胞，收取不同时间点病毒培养物，测定病毒生长曲线。试验结果表明，rHeN-1/2018和rHeN-1/2018-i12病毒在PK-15、IBRS-2和BHK-21中表现相似的生长曲线，其中在PK-15和IBRS-2细胞中病毒滴度明显高于BHK-21细胞，说明两株病毒的细胞嗜性较类似，无明显差异（图6）。此外，通过分析病毒在不同细胞上的生长曲线，发现rHeN-1/2018-i12株在PK15细胞和IBRS-2细胞中生长能力明显弱于rHeN-1/2018。在感染PK15细胞24 h，两者病毒滴度相差可达10倍。在PK-15细胞中，rHeN-1/2018和rHeN-1/2018-i12均在感染后12、24和36 hpi病毒滴度逐步明显上升，但rHeN-1/2018毒株在36 hpi病毒滴度达到最高值，而rHeN-1/2018-i12在48 hpi病毒滴度达到最高。然而，其病毒滴度显著低于亲本毒株rHeN-1/2018。

图6 SVA重组病毒和亲本毒株在不同细胞中的生长曲线

3 讨论

3.1 IRES依赖性翻译过程是病毒蛋白翻译过程启动的重要方式

蛋白的翻译过程包含起始、延伸和终止三个阶段，其中，起始阶段是蛋白翻译的限速阶段，也是调控宿主和病原蛋白表达的重要靶点。蛋白质翻译的启动存在5’m7GpppN帽子依赖性和非依赖性两种方式。帽子非依赖性过程又称为IRES依赖性翻译过程，多见于mRNA缺乏帽子结构的小核糖核酸病毒和黄病毒，在宿主（应激、细胞周期与凋亡相关基因）、DNA病毒（疱疹病毒等）和逆转录病毒部分基因等也能够利用IRES进行翻译[9, 17-18]。病毒感染过程中能够与多种eIFs相互作用（eIF4E、eIF4G、eIF4A等），影响宿主的帽子依赖性翻译过程，而IRES依赖性翻译过程不受影响，为病毒或宿主部分基因的表达创造有利的环境[19-20]。

3.2 IRES序列改变可以影响病毒的复制能力

IRES序列改变或构象发生变化时，能够改变其结合40S核糖体亚基和相关ITAFs的能力，进而影响病毒在不同物种、不同组织及细胞中复制翻译的能力，对病毒的组织嗜性、感染谱及致病性产生一定的影响[9, 17, 21]。脊髓灰质炎病毒（poliovirus, PV）Sabin减毒疫苗株I、II、III型的IRES Domain V中的480位、481位和472位碱基突变，其与ITAFs和40S核糖体亚基结合能力发生改变，导致翻译效率降低，影响病毒的毒力及细胞嗜性[22]。将PV的IRES替换为其他类型的IRES时，重组PV的细胞嗜性和毒力发生明显改变[23]。FMDV IRES翻译过程依赖于核糖体蛋白RPL13和ATP依赖的RNA解旋酶3（DDX3）协同作用，其Domain III/IV替换为牛鼻病毒的IRES Domain III/IV，重组FMDV的细胞嗜性发生明显改变，在猪源细胞上的复制能力明显下降[24]。HCV感染过程中，不同组织分离毒株的IRES区域存在碱基变异，且这些变异毒株的组织嗜性存在明显差异[25]。SVA是一种新发的小核糖核酸病毒，IRES依赖性翻译过程在SVA复制过程中发挥关键性作用。2017年我国境内出现了自然弱毒株GD04/2017，其IRES存在非连续12个碱基的插入[12]。本研究以HeN-1/2018为背景，基于反向遗传操作技术将其IRES Domain II区域插入12个碱基，拯救重组病毒rHeN-1/2018-i12，并进一步证实IRES Domain II区域突变能够明显降低SVA复制能力。

3.3 针对IRES区域改造是研发SVA弱毒疫苗的重要方向

近年来，国内猪群先后出现了猪塞内卡病毒病和非洲猪瘟等新发猪病，该两种病原对环境污染能力强，传染性高，给我国养猪业带来了严重的经济损失[26-27]。其中，SVA疫情持续在美洲和亚洲养猪业发达国家发生，SVA病原在不断进化，基因组发生了突变、插入、重组的现象[4, 12-13]，出现了不同毒力的SVA流行毒株[28]，且在部分地区健康猪群中存在隐性感染带毒的情况[29]，给SVA疫病的防控带来了巨大的挑战。作为一种新发的动物疫病，国内外关于SVA的研究多集中于流行病学调查、毒力基因鉴定、抗病毒免疫等方面[30]，目前世界范围内尚无针对SVA疫病防控的生物制品上市。本研究基于病毒反向遗传操作技术平台构建并成功拯救SVA IRES Domain II区域突变毒株，分析了IRES Domain II区域的突变对SVA生物学特性的影响，有助于我们更好了解SVA致病机制，拓宽我们对IV型IRES结构和功能的认识。针对影响病毒复制和毒力关键IRES区域进行改造，使当前流行的强毒株失去致病性，将有助于构建更加安全有效的弱毒疫苗和分子标记疫苗。

4 结论

基于美系SVA毒株HeN-1/2018为背景，利用反向遗传技术将其IRES 308—317 nt的9个碱基（）和21个碱基（）进行置换，经间接免疫荧光试验和测序鉴定，成功拯救IRES突变毒株rHeN-1/2018-i12，并证实IRES Domain II区域中12个碱基非连续插入突变不能够影响SVA对PK-15、IBRS-2和BHK-21细胞的嗜性，但可以明显降低病毒在感染细胞中的早期复制能力。这一发现，为进一步了解SVA致病机制奠定了基础。

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Effect of 12 Nucleotides Natural Insertion within the Internal Ribosome Entry Site Core Region on the Replication and Cellular Tropism of Porcine Senecavirus A

ZHANG XiaoZhan1, DONG XuanZhi1, LÜ NanNan1，LIU YiWen1, MA XinTian1, WANG LinQing2, XIA YanXun1, JIANG ZengHai1, GUO YunZe1, ZHAO PanDeng1, SONG YuZhen1, YANG DeCheng3, BIAN Chuanzhou1

1College of Veterinary Medicine, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046,2Zhengzhou Key Laboratory of Molecular Biology, Zhengzhou Normal University, Zhengzhou 450044,3Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, Harbin 150069

【Background】Senecavirus A (SVA) is a newly emerged picornavirus causing swine idiopathic vesicular disease and epidemic transient neonatal losses. The internal ribosome entry site (IRES) located in 5’ untranslated region (UTR) of SVA genome plays a critical role in virus replication. In 2017, a natural mutant SVA strain, with 12 nucleotides discontinuously inserted into the IRES core region Domain II, was identified in China, and its replication capacity and pathogenicity changed significantly. 【Objective】The aim of this study was to investigate the effects of IRES Domain II mutations on SVA replication and cell tropism, and to lay a foundation for further understanding the pathogenesis of SVA. 【Method】An IRES mutant plasmid of pHeN-1/2018-i12 based on the background of pHeN-1/2018 were constructed, and the DNA-launched infectious clone of HeN-1/2018, with 9 nucleotides in IRES region of HeN-1/2018 genome (308-317 nt, ACTCAAGCG), were gradually replaced by the 21 nucleotides in GD04/2017 genome (308-328 nt, CACGCCTGCCGATAGACGATT) through multiple site-directed mutagenesis. The recombinant virus rHeN-1/2018-i12 was rescued and then identified by viral nucleotide genome examination, indirect immunofluorescence assay and Western blot assay, which was further examined the effect of 12 nucleotides natural insertion within the IRES core region Domain II on the replication and cellular tropism of SVA. 【Result】The pHeN-1/2018-i12 was then directly transfected into PK-15 cells and the recombinant virus rHeN-1/2018-i12 caused stable cytopathic effect was harvested after twice blind passages. Furthermore, the cellular tropism and growth kinetic of rHeN-1/2018-i12 was further investigated via virus infection assays. The viral genome of the IRES mutant virus rHeN-1/2018-i12 in the fifth and tenth passage were sequenced, and results showed that the IRES mutations passed on to the progeny viruses stably, with no nucleotide mutation in viral genome at fifth passage, and no nucleotide mutation in viral 5’-UTR region at tenth passage. Moreover, the growth characteristics of low passage recombinant virus rHeN-1/2018-i12 were further investigated in porcine cell lines PK-15 and IBRS-2, and hamster cell line BHK-21. The results showed that the recombinant virus rHeN-1/2018-i12 shared similar cellular tropism and growth dynamics with parental virus rHeN-1/2018, and all the two viruses could cause obvious CPE in PK-15 cells, IBRS-2 cells and BHK-21 cells, which indicated the mutation of 12 nucleotides insertion in the IRES core region Domain II had no significant difference in cellular tropism. Importantly, the virus-induced CPE time of rHeN-1/2018-i12 was later than that of rHeN-1/2018, and the viral titer of rHeN-1/2018-i12 was also lower than that of rHeN-1/2018 at the same time point post infection, especially at the 24 hpi, the difference of virus titer between the two viruses can be up to 10 times. 【Conclusion】The IRES mutant virus rHeN-1/2018-i12 was constructed and rescued, and further confirmed the influence of IRES mutation on SVA viral biological characteristics in this study, which provided an insight of the pathogenesis of SVA, and broadened our understanding of the function of viral type IV IRES.

sencavirus A; internal ribosome entry site; reverse genetics system; virus replication; cellular tropism

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.07.015

2023-09-12；

2023-12-31

国家自然科学基金（32002264）、河南省高校科技创新人才支持计划（24HASTIT061）、河南省科技攻关项目（232102110109）、河南省自然科学基金（222300420586）、河南牧业经济学院兽医重点学科基金（XJXK202202）

张晓战，Tel：0371-86176275；E-mail：zhangxz@hnuahe.edu.cn。通信作者边传周，Tel：0371-86176197；E-mail：chuanzhou-bian@126.com。通信作者杨德成，Tel：0451-51051774；E-mail：yangdecheng@caas.cn

（责任编辑 林鉴非）