百合萜烯合成相关基因LiGGPPS大小亚基基因的克隆、表达及功能分析

刘旭平 王浩楠 张茜 冷平生 胡增辉

摘 要 香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS）是调节萜类化合物生物合成的关键酶，为了研究GGPPS基因在百合萜类物质合成中的作用，本试验以‘西伯利亚百合（Lilium ‘Siberia）为试材，克隆了GGPPS大亚基（LiGGPPS.LSU）和小亚基（LiGGPPS.SSU）基因，并分析其表达和功能。通过生物信息学分析、相对表达量分析、荧光定量PCR、亚细胞定位、基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）预测并验证其特征及功能，揭示其表达模式。结果表明，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分别为1 100 bp和1 040 bp，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU的氨基酸序列与其他物种的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU的氨基酸序列具有较高的一致性，系统进化树显示它们分别与薯蓣（Dioscorea cayenensis subsp. rotundata）和深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）亲缘关系最近。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因均定位在叶绿体中，表达量随百合的生长发育呈现先上升后下降的趋势。LiGGPPS.LSU在花被片中高量表达，LiGGPPS.SSU在花药中显著高量表达。VIGS试验显示芳樟醇、罗勒烯、月桂烯释放量下降。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因对百合花香单萜类物质合成具有重要作用，本试验为进一步研究百合GGPPS以及相关代谢途径提供理论基础。

关键词  ‘西伯利亚百合；GGPPS；萜烯化合物；基因克隆；表达分析

释放花香是开花植物的重要特性［1］。花香在吸引传粉者［2-3］和抵御病虫害［4-5］等方面具有重要作用。花香也是花卉重要的观赏性状，对于提升花卉的观赏和经济价值具有重要作用。花香物质由一系列低分子量挥发性有机化合物组成，包括萜烯类、苯环类/苯丙烷类、脂肪族类、含硫化合物和含氮化合物等 ［6］。萜烯化合物是植物产生的众多化合物中最大的一类，如芳樟醇、罗勒烯和月桂烯等［7］，是许多植物花香的主要成分，揭示其合成機制对于进一步了解其功能，进而进行调控奠定基础。

目前已经清楚，萜烯化合物源自异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和它的同分异构体二甲基烯丙基焦磷酸 （dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），二者可通过位于质体的甲基赤藓糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径和胞质中甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径合成［8］。这两种途径的类异戊二烯通量在多个层面受到严格调控，除受通路基因及其并行同源基因的转录调控，还受转录后/翻译水平和反馈调节的控制［9］。香叶基香叶基焦磷酸合酶（farnesyl/geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）处于途径下游，能够催化1分子DMAPP和3分子IPP通过3个连续的缩合步骤形成GGPP ［10］。GGPPS负责类胡萝卜素等的生物合成［11］，参与催化蛋白的异戊二烯化［12］，同时也是控制植物代谢中“碳流”方向的类异戊二烯化合物［13］。植物中已经发现了同源和异源二聚体两种类型的GGPPS，异源二聚体GGPPS由一个非活性小亚基（SSU）和一个大亚基（LSU）组成［14］。SSU自身不具有催化活性，不能通过形成同源二聚体催化反应，但能够与LSU或GPPS互相作用，调节后者发挥生物学功能，改变GGPP和GPP生物合成的比例［15］。目前，已在芒果（Mangifera indica）［16］、竹叶花椒（Zanthoxylum armatum）［17］、山鸡椒（Litsea cubeba）［18］、茉莉花（Jasminum sambac）［19］、栀子（Gardenia jasminoides）［20］等植物中发现GGPPS基因对萜烯合成具有重要作用，但GGPPS大亚基和小亚基基因在百合中尚未被克隆，在百合花香萜烯合成中的作用还不清楚。

萜烯是植物花香的主要成分［21］，也是多种百合花香的关键成分。由于在长期育种过程中忽视花香［22］，造成不同品种百合间花香存在显著差异，有些百合香气过浓，有些过淡［23］，均影响其观赏和应用价值，因此改造花香，培育花香怡人的新品种是百合育种的热点方向。萜烯化合物的差异释放被认为是造成百合花香差异的主要原因［24］，因此，查清萜烯合成调控机制是开展百合花香定向育种的基础和依据。

本研究以东方百合‘西伯利亚（Lilium ‘Siberia）为材料，克隆LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因，通过生物信息学分析、相对表达量分析、荧光定量PCR、亚细胞定位、VIGS功能验证以及蛋白的互作分析，预测并验证其特征及功能，揭示其表达模式，为揭示LiGGPPS基因大亚基和小亚基在‘西伯利亚百合单萜物质合成中的作用和功能奠定基础，为开展百合花香育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为‘西伯利亚百合实生苗（种球购自北京荷景良苑贸易有限公司），以盆播的方式种植于北京农学院单坡面温室大棚（40° 5′24″N， 116° 17′55″E）中，栽培基质中草炭土与蛭石的体积比为2∶1，给予适当的田间养护。

选取生长状态良好、无病虫害、均高1 m的植株，采集花蕾期、初开期、半开期、盛开期和衰败期的花被片和盛开期百合的根、茎、叶、外花被片、内花被片、子房、花药、花柱和花丝，经液氮速冻后迅速转移至-80 ℃超低温冰箱保存。每组样品设3次生物学重复。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取与反转录 使用RNA提取盒TransZol Up Plus RNA Kit（全式金，ET111- 01）分别提取5个花期的‘西伯利亚百合花被片和盛开期百合各组织的RNA，电泳后检测该RNA的质量及浓度，使用反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金，AT311-02）将样品RNA反转录成cDNA。

1.2.2 基因全长克隆 通过3代转录组数据筛选出LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因。使用SnapGene软件设计全长扩增引物（表1），以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：FastHiFi PCR MasterMix   12.5 μL，cDNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应的条件为：98 ℃预变性 3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火  30 s，72 ℃延伸1 min，共33个循环。然后对产物进行纯化回收、连接转化、测序鉴定及比对分析。

1.2.3 生物信息学分析 使用NCBI在线软件CD-Search进行基因保守结构域检索，通过BLAST软件进行序列比对，从检索结果中随机下载若干序列。使用MEGA11软件中的Muscle算法进行多序列比对，采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，步长检验（Bootstrap Replication）1 000次。使用WoLF PSORT在线软件（https：∥wolfpsort.hgc.jp/）预测亚细胞定位。

1.2.4 相对表达量分析 根据克隆得到的LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因，使用Primer Primier软件设计荧光扩增引物（表1），将9.5 μL ddH2O、1 μL Forward GSP、1 μL Reverse GSP、1 μL cDNA、12.5 μL 2× SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Takara，RR420A）注入八联排管各孔中，进行qRT-PCR分析。根据相对表达量公式2-ΔΔCt计算基因的相对表达量，分析显著性差异并作图。

1.2.5 VIGS功能验证 选取LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因开放阅读框200 bp序列插入到酶切后的pTRV2载体中，设计引物LiTGGPPS.LSU-F/R和LiTGGPPS.LSU-F/R（表1）对目的基因片段进行同源克隆。利用同源重组法构建pNCTRV2-LiGGPPS.LSU和pNCTRV2-LiGGPPS.SSU沉默载体，转化到农杆菌感受态GV3101细胞中。挑取转化单菌落到Kan+和Rif+液体培养基中，菌液PCR检测阳性转化菌株。制备农杆菌VIGS菌液，采用注射法侵染‘西伯利亚百合花被片，同时以注射空载体pNC-TRV2菌液的植株和WT作为对照组。将处理后的植株于20 ℃培养间遮光处理12 h后转为正常光照，培养7 d后进行实时荧光定量PCR。采用固相微萃取方法采集花香物质，通过GC-MS联用技术测定花香释放量，使用MSD Productivity ChemStation的NIST14鉴定挥发物的成分［25］，使用Excel 2020统计数据。

2 结果与分析

2.1 基因克隆

如图 1所示，克隆得到的LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU片段分别为1 100 bp和  1 040 bp。经切胶回收，连接转化，测序比对，确定目的基因的最终序列。

2.2 生物信息学分析

经序列比对（图2），LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU与其他物种的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU序列具有较高一致性，可能具有相似的功能。系统进化树（图3）显示LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分别与薯蓣（Dioscorea cayenensis subsp. rotundata）和深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）亲缘关系较近。

2.3 花期表达特性分析

如图4所示，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU在‘西伯利亚百合5个不同花期中的表达量具有显著性差异（P<0.05），随着百合的生长发育，呈现先上升后下降的趋势。LiGGPPS.LSU的表达量在初开期达到峰值，在衰败期的表达量最低；LiGGPPS.SSU的表达量在盛开期达到峰值，在花蕾期的表达量最低。LiGGPPS.LSU在初开期和半开期的表达量相近；LiGGPPS.SSU在初开期、半开期和衰败期的表达量相近，是花蕾期表达量的3倍。

2.4 组织表达特性分析

如图5所示，LiGGPPS.LSU在花被片中高量表达，LiGGPPS.SSU在花藥中显著高量表达，在叶片和子房的表达量均最低。

2.5 VIGS功能验证

图6-A显示，沉默株系中LiGGPPS.LSU和GGPPS.SSU基因表达量显著降低，沉默效率为89%和85%。图6-B显示，与对照组（pNC-TRV2侵染的花瓣和野生型正常生长的花瓣WT）相比，发病植株花被片单萜释放量大幅下降。基因沉默后，单萜物质芳樟醇、罗勒烯、月桂烯较WT相比，分别下降了12.3、14和8.3倍和20、17.7和5倍。

3 讨  论

萜烯化合物是植物花香的主要成分，也是多种百合花香的关键成分。GGPPS家族中有部分同源基因对萜类代谢起着关键的调控作用，能显著影响植物体内萜类化合物的合成［18］。但GGPPS基因大亚基和小亚基在百合中尚未被克隆，本试验利用‘西伯利亚百合克隆LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分别为1 100 bp和1 040 bp。LiGGPPS.LSU的表达量在初开期达到峰值，然后逐渐减小，于花被片中高量表达；LiGGPPS.SSU在盛开期表达量最高，在花药中表达量  显著。

‘西伯利亚百合MEP途径上游合成酶基因LiDXS与LiDXR在叶绿体中特异表达，在盛开期高量表达，在花被片中表达量显著［26］。单萜合酶基因LiTPS基因在花被片中高量表达，在盛开期表达量最高［27］。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU与LiDXS、LiDXR、LiTPS存在于同一个通路中，且基因时空表达具有相同的特征，说明LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU可能在单萜合成中发挥重要作用。通过VIGS试验发现，发病植株花被片单萜释放量及其相关合成基因的表达量均显著下降，证明LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU在单萜合成中具有重要作用。

水稻GGPPS的二聚狀态由GGPPS融合蛋白（GRP）控制，OsGGPPS1与OsGRP聚合形成的异源二聚体比OsGGPPS1同源二聚体的催化效率更高，说明它可能通过决定OsGGPPS1在叶绿体中的分配，影响GGPP向下游途径的代谢流量［28］。对胡椒薄荷（Mentha piperita）和仙女扇（Clarkia breweri）的研究说明SSU和LSU/GGPPS的结合可以增强异源二聚体的GPPS催化特性［29］。啤酒花 （Humulus lupulus）中，SSU与HlGPPS.LSU形成异源二聚体，产生GPP和GGPP，且酶活性显著高于  HlGPPS.LSU自身催化效率［30］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtGGPPS.LSU和AtGGPPS.SSU共同参与了单萜的生物合成［31］。在金鱼草（Antirrhinum majus）中，单独不具有活性的GGPPS.SSU在体内可以和GGPPS.LSU以疏水作用结合形成异源二聚体调节GGPPS.LSU的活性［32］。烟草（Nicotiana tabacum）GGPPS.LSU能够形成同源二聚体，催化GGPP的合成。但与AmSSU I结合后，转基因烟草中单萜类物质含量增加［33］。

4 结  论

GGPPS.LSU和GGPPS.SSU是萜类化合物合成中重要的结构基因，可能共同参与了MEP途径中烯萜化合物的合成，对于调控‘西伯利亚百合花香物质合成具有重要的作用。本研究对深入揭示百合萜类合成的分子机制有重要作用，为进一步研究植物中GGPPS以及相关代谢途径提供理论基础，也为今后利用转基因技术调控植物萜烯化合物合成提供了研究思路。

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Cloning， Expression and Functional Analysis of LiGGPPS.LSU  and LiGGPPS.SSU Involved in Flower Fragrance Synthesis in Lilium

Abstract Geranylgeranyl pyrophosphate synthase（GGPPS） is a crutial enzyme that regulats terpenoid biosynthesis in plants. To investigate the role of GGPPS genes in lily terpenoid synthesis， we cloned LiGGPPS. LSU and LiGGPPS.SSU genes and analyzed their expression and function using ‘Siberian lily as test material. Bioinformatics analysis， relative expression analysis， fluorescence quantitative PCR， subcellular localization， VIGS（virus induced gene silencing） and yeast two-hybrid were used to predict and verify their characteristics and functions， and to reveal their expression patterns. Results showed that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU were 1 100 bp and 1 040 bp，respectively， with the amino acid sequences that   had high similarity with those of other species.Phylogenetic analysis showed that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU had the closest relationship with DcGGPPS.LSU and AsGGPPS.SSU in Dioscorea cayenensis subsp.rotundata  and Apostasia shenzhenica. Both LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU were localized in the chloroplasts， and their expression showed an rising trend， followed by declining trend as the flower grew and developed. LiGGPPS.LSU was highly expressed in the tepals，while LiGGPPS.SSU was highly expressed in the anthers. The VIGS assay showed a decrease in the release of linalool， basilene and lauricene. The findings suggest that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU genes play an important role in the synthesis of monoterpenes in lily flowers，providing a theoretical basis for further research on LiGGPPS and related metabolic pathways.

Key words  Lilium ‘Siberia; GGPPS; Terpene compounds; Gene cloning; Expression analysis