基于改变相比法结合HS-GC-MS 测定烟丝基质中酯类单体香料的固-气分配系数

2024-04-10赵佳明付英杰罗曾源卢斌斌陈帅伟王增瑜宗永立孙世豪

烟草科技 2024年3期

赵佳明，付英杰，罗曾源，席辉，卢斌斌，张帅，陈帅伟，王增瑜，宗永立，李军*，孙世豪*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 山东中烟工业有限责任公司技术中心，济南市历下区经十路11888 号 250014

消费风味产品时，风味成分从产品（固体、液体或凝胶）中释放出来，为消费者所感知［1］。消费者感受到风味产品的风味特征并非产品中所含风味成分的简单加和，而是消费过程中风味成分释放特征的综合体现，这不仅受产品中风味成分浓度和理化性质的影响，也取决于构成产品主体的其他化学物质（如水、糖、有机酸和蛋白质等），即基质成分［2］。产品中风味成分的种类差异及其从基质中释放的行为差异共同塑造了差异化和特征化的产品风味。因此，在特定的基质背景下，阐述风味成分的释放行为特征对于产品风味的调控和风格塑造具有理论支撑意义和实际应用价值。卷烟是一种特殊的嗜好型风味产品，为了使消费者得到更加舒适的感官体验，通常会在卷烟中添加一些风味物质以改善和丰富卷烟香味和吃味特征，掩盖杂气，减少刺激性，或者赋予烟气某些特征香气，达到塑造产品风格特征的目的。因此，阐明风味成分在卷烟释放过程中的行为差异，可对今后更加科学合理地使用单体香料提供技术支撑。为了探明单体香料在卷烟中的释放规律，研究人员对不同种类烟用单体香料在烟草基质（卷烟、加热卷烟）中的转移行为进行了深入的研究［3-4］，通过考察酯类单体香料在烟支内部（烟丝、滤嘴）的持留率、迁移率［5-8］以及酯类单体香料在烟气中的转移率［9-11］尝试揭示其在卷烟中的转移规律。风味成分的迁移率/转移率反映的是烟气中风味成分的最终释放结果，对于卷烟加香有很大的指导意义；但无论是单体香料在烟气中的总转移率还是逐口转移率，均是单体香料由烟草基质中释放到气相并转移进入烟气，再经历冷凝吸附和截留［12-13］等作用，最终在烟气中呈现，其体现的是风味成分最终释放的累积结果，对风味成分在卷烟中的释放行为差异解释较为有限。

固-气分配系数（K）定义为分析物在固相中或固相上的浓度与其在气相中质量浓度的平衡比［14］。固-气分配系数能很好地反映分析物在固相或气相中的分配释放能力，是许多应用中的重要参数，例如，表征食品中风味成分释放能力大小的参数，用于香气释放研究［15-16］；评估包装材料的安全性能，以尽量减少挥发性有机化合物（VOCs）的释放［17］。此前，分配系数的测定大多处于液体体系当中，其他固相体系中所使用的微量点滴法［18］也不适用于烟草基质中单体香料分配系数的测定。因此，开发准确可靠的方法测定烟草基质中目标化合物的固-气分配系数很重要。基于此，本研究中以6 种酯类单体香料为研究对象，建立了适用于烟草基质中单体香料固-气分配系数的检测方法，旨在为烟草基质中单体香料释放行为研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

云南玉溪产C3F等级烟叶切后烟丝样品。

乙酸丁酯、乙酸戊酯（≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙酸异戊酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、异戊酸乙酯（≥99%，梯希爱化成工业发展有限公司）；无水乙醇（色谱纯，德国Merck 公司）。其理化性质见表1。

表1 香气化合物的理化性质Tab.1 Physicochemical properties of the studied aroma compounds

O37-医用喉头喷雾器（江苏平安医疗器械有限公司）；CP224S 型电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartious 公司）；Lab Dancer 涡旋振荡器（德国IKA 公司）；8890/5977B 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；MPS robotic 多功能进样平台（德国Gerstel公司）。

1.2 方法

1.2.1 改变相比法测定理论

分配系数（K）表示一种挥发性化合物在热力学平衡时在固相（Cs）与气相（Cg）中的质量浓度之比：

式中：K为热力学平衡状态下香气化合物的分配系数，Cs为平衡时香气化合物在固相（烟丝）中的质量浓度，g/cm3；Cg为平衡时香气化合物在气相中的质量浓度，g/cm3。

两相间的质量浓度也可以描述为

式中：ms为平衡时香气化合物在固相中的质量，g；mg为平衡时香气化合物在气相的质量，g。

因此，联立公式（1）、（2）和（3）可得公式（4）。

式中：β为顶空瓶中气相（Vg）与固相（Vs）的体积之比。

式中：Cs*为顶空瓶内烟丝中香气化合物的初始质量浓度，g/cm3。联立公式（3），可以表示为

公式（10）最初由Ettre 等［19］建立，等式两边取倒数，得公式（11）：

在顶空分析时，色谱峰面积与顶空气相中的平衡浓度成比例，见公式（12）：

式中：A为顶空瓶内待测化合物在给定温度下达到热力学平衡时色谱峰的面积，fi为检测器的响应系数。联立公式（11）与（12）可得：

式中：a=K/（fi·Cs*），b=1/（fi·Cs*）。

1.2.2 加香烟丝及顶空分析样品制备

加香烟丝样品：将未添加任何香料的云南C3F切后烟丝过孔径0.250 mm（60 目）筛除杂，过滤掉烟丝废渣、烟末和梗签，放置在（22±1）℃，相对湿度60%±3%的恒温恒湿箱中平衡48 h 以上。称取50 g平衡后的烟丝，按其质量的0.01%称取1.1 节中所选用的6 种酯类单体香料，以8 mL 无水乙醇稀释后，用医用喉头喷雾器均匀地喷洒在烟丝表面，加香过程中保持翻动以保证加香均匀，将制备好的加香烟丝样品置密封袋中保存48 h。

顶空分析样品：将不同质量的加香烟丝分别放入20 mL 顶空瓶中，密封后放入MPS 多功能进样平台，由全自动进样器置于孵化器中，孵化平衡条件：60 ℃，240 min；65 ℃，240 min；70 ℃，120 min；75 ℃，120 min；80 ℃，90 min；90 ℃，90 min；100 ℃，45 min；110 ℃，45 min。

将制备好的样品进行HS-GC-MS 分析。分析条件：

MPS多功能进样平台条件：

孵化器分别在60、65、70、75、80、90、100、110 ℃下孵化；自动进样平台气密针注射温度：70～120 ℃（气密针温度设定高于孵化温度10 ℃）；气密针填充速率：250 μL/s；气体注射速率：250 μL/s；进样量：1 000 μL。

色谱条件：

色谱柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：氦气；进样模式：分流进样；分流比：10∶1；进样口温度：250 ℃；程序升温：50 ℃（7 min）250 ℃（1 min）；传输线温度：280 ℃；EI 离子源温度：230 ℃；电离能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：选择离子监测；质量扫描范围：30～350 amu；溶剂延迟：5 min。

1.2.3 加香烟丝堆积密度测定［20］与β计算

称取20 mL 顶空瓶的质量，记为m0。使用称量纸和镊子将加香后烟丝置于20 mL顶空瓶中，并手持顶空瓶在桌面上振动10 次，辅助使用涡旋振荡器振荡顶空瓶，使烟丝自由堆积密实，直至烟丝在顶空瓶瓶口处的高度不再变化。称取20 mL 顶空瓶与填充后烟丝的总质量，记为m1，烟丝的堆积密度（ρ，g/mL）按照公式（16）计算：

式中：VL表示顶空瓶体积，cm-3；VS表示顶空瓶中烟丝基质的体积，cm-3。

测定烟丝堆积密度，从而确定顶空瓶中所加入不同质量比烟丝对应的气-固两相体积比β。使用同一批次加香后烟丝重复5 次实验，测得其平均堆积密度为0.15 g/cm3，RSD为2.61%。在体积为20 mL 的5 个顶空瓶中分别加入0.15、0.30、0.45、0.60 和0.75 g 的烟丝（对应的β值分别为19.00、9.00、5.67、4.00和3.00）。

1.2.4 数据处理

使用Origin 2019 软件对β与色谱峰面积倒数（1/A）进行线性回归分析。

2 结果与讨论

2.1 基于改变相比法的分配系数测定方法建立

将不同体积的待测烟丝分别放入5 个顶空瓶中密封，用HS-GC-MS 法分别测定每个样品，因为每个样品中待测成分是相同的，且处于同一温度下，所以其分配系数相同。同时，因为每个相热力学系统是相同的，所以联立几次独立的顶空检测结果就可以计算出Kcut/air值。此外，分配系数的测定受温度、β、平衡时间和基质体系作用力等多方面的影响；其中，β与平衡时间对方法精确度的影响很大，因此需要对β与平衡时间两个实验条件进行优化，提高测定方法的准确度。

2.1.1 顶空固相体积优化

采用改变相比法测定分配系数时，需要待测化合物处于热力学平衡状态下，测定每一个β值下所对应的化合物色谱峰面积。β的选择对方法的精确度有很大影响，当体积比过小或过大时，均无法得到准确的分配系数Kcut/air值［21-22］。如图1 所示，在添加1.00 g 烟丝时，烟丝占据了顶空瓶较大的体积，气密针在扎取采样时存在与烟丝接触的现象，导致气密针吸取体积小于设定体积，色谱峰面积（对应的β值为2.00）小于添加0.80 g（对应的β值为2.75）烟丝时的色谱峰面积。本研究中通过优化β实验得到了结论：在测定烟丝基质中酯类单体香料在固-气两相间的分配系数时，应避免出现固相体积过大导致气密针与烟丝基质接触的情况，选择β值在3.00～19.00 范围内较为合适。

图1 60 ℃条件下β优化前后异戊酸乙酯所对应的色谱峰面积Fig.1 Chromatographic peak areas corresponding to ethyl isovalerate before and after optimized β values at 60 ℃

2.1.2 顶空平衡温度选择及平衡孵化时间优化

顶空平衡温度可选择范围为30～200 ℃，但是当平衡温度过高时，会破坏原有基质结构，从而影响加香成分在固-气两相间的分配。低碳酯类单体香料热稳定性相对较低，处于烟支冷凝区较低温度时，就已经开始释放。此外，温度较高时其分子活动剧烈，不同酯类单体香料间释放差异较不明显。因此，选择处于冷凝区温度区间的60～110 ℃平衡温度作为实验温度，其中，90、100、110 ℃作为分配系数测定的外推温度。

为了保证加香成分在设定温度下达到固-气两相间分配平衡，在60～110 ℃内考察平衡孵化时间对烟丝中6 种低碳酯类加香成分丰度的影响［23］，结果如图2 所示。由图2a 可知，随着平衡孵化时间增加，6 种酯类单体香料在60 ℃条件下的色谱峰面积不断增加；当平衡孵化时间大于240 min 时，色谱峰面积趋近于稳定。图2b 中6 种酯类单体香料在70 ℃条件下于120 min 时基本达到平衡状态。图2c、2d 表明，在80、100 ℃条件下，6 种酯类单体香料分别在90、45 min时达到平衡。因此，选择240 min作为60、65 ℃条件下的平衡孵化时间；选择120 min 作为70、75 ℃的平衡孵化时间；选择90 min 作为80、90 ℃的平衡孵化时间；选择45 min 作为100、110 ℃的平衡孵化时间。

图2 不同温度下顶空平衡孵化时间对目标物色谱峰面积的影响Fig.2 Effects of headspace equilibrium incubation time at different temperatures on chromatographic peak areas of the target compounds

2.1.3 分配系数Kcut/air测定方法评价

采用HS-GC-MS 法逐个测定每个待测样品的顶空平衡色谱峰面积，结果见图3。通过绘制色谱峰面积倒数（1/A）与β的曲线得到线性回归方程，结果见图4。以异戊酸乙酯为例，将线性方程中的截距（a）与斜率（b），按照k=a/b计算得到其在烟丝基质中的固-气分配系数Kcut/air。

图3 不同β值所对应的异戊酸乙酯色谱峰面积Fig.3 Peak areas of ethyl isovalerate corresponding to different β values

以β为自变量（X），色谱峰面积倒数（1/A）为因变量（Y），进行线性回归分析，得线性回归方程和相关系数（R2），并计算5 次重复实验的相对标准偏差（RSD），结果见表2。

表2 6种酯类单体香料在不同温度条件下的线性回归方程、相关系数（R2）Tab.2 Linear regression equations and correlation coefficients（R2）of six monomer ester flavors at different temperatures

根据文献［24-25］报道，基于改变相比（Phase ratio variation，PRV）方法，利用PRV-HS-GS-MS 检测溶液基质中化合物的分配系数时，色谱峰面积倒数与β的线性回归方程的相关系数（R2）均大于等于0.990。由表2 可知，在60～110 ℃条件下，6 种酯类单体香料方程线性关系良好，R2≥0.991，RSD为0.92%～9.14%。表明该方法重复性较好，适用于烟丝等固相基质中酯类香料分配系数的测定。

2.2 烟丝基质中单体香料的分配系数分析

2.2.1 酯类单体香料的分配系数与温度的关系

温度对烟丝中酯类单体香料释放的影响如表3 所示。可知，总的趋势是，随着温度的升高，Kcut/air值逐渐减小。这表明随着温度的升高，单体香料与烟丝基质的吸附结合作用变弱，香料的释放行为增强，在气相中的分配增加。进一步分析互为同系物、同分异构体的香料单体的分配系数可知，互为碳链异构的异戊酸乙酯与乙酸异戊酯，乙酸异戊酯分子的对称性更好，色散力较大，具有较高的结构稳定性，其分配系数也更大。此外，分配系数的大小不仅与化合物自身的结构有关，也与基质有关［26-27］。在65 ℃时乙酸丁酯、乙酸异戊酯与异戊酸乙酯的分配系数以及100 ℃时丁酸乙酯与异戊酸乙酯的分配系数较为接近，此时，酯类单体香料与烟丝基质之间的作用力可能是主要的决定因素。

表3 6种酯类单体香料的Kcut/air值Tab.3 Kcut/air values of six monomer ester flavors

绘制lnK和热力学温度倒数（1/Tabs）之间的回归曲线，如图5 所示，可以发现lnK和1/Tabs间基本呈线性关系。因此，可以描述为公式（18），在公式（18）中a"和b"是回归系数，斜率（b"）是反映分析物分配系数与温度关系的直接系数。此外，lnK与1/Tabs之间的线性关系也可以检验分配系数数据的准确性［28］，即lnK-1/Tabs回归曲线的R2>0.9 时，可证明分配系数测定结果的准确性。虽然从乙酸丁酯和异戊酸乙酯的回归曲线上能观察到存在轻微曲率，但在研究范围内的线性关系（如相关系数所示）仍然良好，这也意味着，在本研究中的温度条件下测定的6 种酯类单体香料的固-气分配系数，在合理范围内可以外推至其他温度范围，尤其是高于顶空最高温度（200 ℃）的温度范围［25］。

图5 6种酯类单体香料Kcut/air的对数值与热力学温度倒数的线性回归分析结果Fig.5 Results of linear regression analysis of Kcut/air logarithmic values and thermodynamic temperature reciprocals for six monomer ester flavors

式中：a"和b"为回归方程回归系数，a"为截距，b"为斜率。

2.2.2 酯类单体香料的分配系数与释放预测

酯类单体香料分配系数的大小对应了在该温度下酯类单体香料由烟丝基质释放到气相过程中能力的大小，将lnK和1/Tabs的回归曲线作为预测方程，以90、100 和110 ℃（对应图中温度倒数绝对值2.75×10-3、2.68×10-3、2.61×10-3K-1）作为外推温度进行预测，结果如表4、图6 所示。从图6 可以看出，6 种酯类单体香料分配系数的实际测定值与预测值相对误差不大，预测拟合程度较好。6 种酯类单体香料在90、100 和110 ℃下分配系数的实际值与预测值的平均相对误差在1.04%～5.32%范围内，预测效果较好，可为实验温度区域之外的分配系数测定提供一定的数据支持。

图6 6种酯类单体香料Kcut/air对数值的预测方程Fig.6 Prediction equations for Kcut/air logarithmic values of six monomer ester flavors

表4 6种酯类单体香料在不同温度下的Kcut/air实际值和Kcut/air预测值及其平均相对误差（AE）Tab.4 Actual and predicted Kcut/air values and average relative errors of six monomer ester flavors at different temperatures

此外，有研究表明，疏水性香气化合物在油溶液中的油-气分配系数在设定温度下可以准确地预测香气化合物的释放速率（μg/s）［29］。目前，关于分配系数的研究多是基于恒定的低温度场体系下进行的［30］，而烟草基质中单体香料的释放往往涉及温度的变化，Kcut/air值反映的是对应温度下该单体香料从烟草基质释放到气相中的能力，对于温度变化过程中单体香料的动态释放的预测存在一定局限性。若假设烟支中烟丝升温是与时间（t）相关的函数，如公式（19）所示：

式中：t为时间，s；φ（t）表示时间的函数；f 为常数参数。

则lnK和1/T线性回归方程的斜率（b"）从一定程度上可解释烟丝基质中酯类单体香料在温度变化过程中的释放行为差异，以及预测其在动态释放过程的释放行为差异。