香芹酚-β-D-葡萄糖苷的合成及在卷烟中的应用

张改红，石栋栋，许 航，杜 帅，尚紫博，谢俊杰，白 冰，毛多斌

郑州轻工业大学烟草科学与工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道136 号 450001

糖苷又被称为潜香化合物，是许多天然香味成分的前体物质［1-4］，本身无味或气味很弱，在常温下性质较稳定，不易挥发、不易氧化分解，但在加热、水解、酶解等条件下，糖苷键断裂会释放出具有特征香味的成分，从而达到缓释香气的目的［5-8］。因此，糖苷在烟草、食品等领域有较好的应用前景。张改红等［9］合成了酱油酮葡萄糖苷，将其应用于卷烟中可以释放出酱油酮，改善卷烟香气品质。段海波等［10］合成了玫瑰醇-β-D-葡萄糖苷，将其应用于卷烟中可以减轻卷烟烟气刺激性，改善香气，使释香更均匀。曾世通等［11］合成了β-紫罗兰醇葡萄糖苷，将其加入卷烟中裂解可以生成多种香味成分，释香均匀稳定。梁德民等［12］将合成的丁香酚-β-D-葡萄糖苷加入卷烟中抽吸时能释放出丁香酚，并且丁香酚-β-D-葡萄糖苷具有良好的释香稳定性和均匀性。

香芹酚（2-甲基-5-异丙基苯酚，FEMA 2245，COE 2055）具有麝香草酚气味及草药香气，天然存在于牛至、樟木等植物的挥发油中［13-14］，广泛用作烟用香料、食品添加剂、抗氧剂等［15-16］。香芹酚作为一种重要的烟用香料，对卷烟香气具有正向作用，但香芹酚在空气中易挥发、易氧化［17］，严重影响了其在卷烟加香中的稳定性。香芹酚-β-D-葡萄糖苷作为香芹酚的香味前体物，有望解决香芹酚在卷烟加香中存在的易挥发、加香不稳定等问题。但关于香芹酚-β-D-葡萄糖苷的合成、热裂解、在卷烟中的热解释放行为及加香应用鲜见报道。因此，本研究中先利用相转移催化法合成香芹酚-β-D-葡萄糖苷，然后通过热裂解-气相色谱-质谱（Py-GC-MS）技术考察香芹酚-β-D-葡萄糖苷的热裂解行为，并通过GC-MS 法考察其在主流烟气粒相中的热解释放行为，旨在为香芹酚-β-D-葡萄糖苷类香料前体物的加香应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烤烟型卷烟样品（浙江中烟工业有限责任公司提供）。

香芹酚（99%，国药集团化学试剂有限公司）；四丁基溴化铵（Tetra-n-butylammonium bromide，TBAB，99%，北京百灵威科技有限公司）；乙酰溴-α-D-葡萄糖（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二氯甲烷（AR，太仓沪试试剂有限公司）；2,6-二氯甲苯（99%，山东禹王和天下新材料有限公司）。

CIJECTOR 香精香料注射仪（德国Burghart 公司）；RM20H 吸烟机（德国Brogwaldt 公司）；AB Sciex Triple TOF 6600 超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪（美国SCIEX 公司）；Avance Ⅲ超导核磁共振波谱仪（600 MHz，瑞士Bruker 公司）；Vertex 70 傅里叶变换红外光谱仪（美国Bruker公司）；7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 科技有限公司）；MS205DU 电子天平［感量0.01 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；微孔滤膜（孔径0.22µm，南京全隆生物技术有限公司）；剑桥滤片（直径44 mm，德国Borgwaldt KC GmbH 公司）。

1.2 方法

1.2.1 合成方法

采用相转移催化法合成香芹酚-β-D-葡萄糖苷：将香芹酚（Ⅱ）与乙酰溴-α-D-葡萄糖（Ⅰ）进行糖苷化反应得到香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷（Ⅲ），再在CH3ONa/CH3OH 体系中脱去4 个乙酰基得到香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）。具体合成路线如图1所示。

图1 香芹酚-β-D-葡萄糖苷的合成路线Fig.1 Synthesis route of carvacrol-β-D-glucopyranoside

1.2.1.1 香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷（Ⅲ）的合成

向500 mL 的圆底烧瓶中加入3.00 g（20 mmol）香芹酚、6.45 g（20 mmol）TBAB、8.22 g（20 mmol）乙酰溴-α-D-葡萄糖和100 mL 二氯甲烷，然后在混合物中添加40 mL 1 mol/L 的NaOH，室温（25 ℃）下搅拌反应2 h。反应过程中采用薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）进行监测，以V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶2 的混合溶剂为展开剂。反应完毕后，向反应液中加入100 mL 乙酸乙酯进行稀释，用100 mL 饱和NaCl水溶液洗涤3 次，合并有机相，向有机相中加入无水硫酸镁，干燥12 h后过滤、减压浓缩，得到4.08 g白色固体即为化合物Ⅲ。收率为42.5%。

1.2.1.2 香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）的合成

向500 mL 的圆底烧瓶中加入2.40 g（5 mmol）香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷、150 mL 无水甲醇和15 mL 0.2 mol/L 的CH3ONa/CH3OH 溶液，室温下搅拌4 h。反应过程中采用TLC 法进行监测，展开剂为V甲醇∶V二氯甲烷=1∶10的混合溶剂。反应完毕后，停止搅拌，加入适量硅胶粉，减压浓缩，得到黄色粉末。采用硅胶柱层析法分离，先用V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶3的混合溶剂进行洗脱，再用V甲醇∶V二氯甲烷=1∶16的混合溶剂进行洗脱。收集洗脱液，经减压浓缩，得到1.21 g白色固体即为化合物Ⅳ。收率为77.5%。

1.2.2 香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）的Py-GC-MS分析

采用Py-GC-MS 技术对化合物Ⅳ进行热裂解分析。在He气氛围、无氧状况下，分别对样品进行3个不同温度下（300、600、900 ℃）的热裂解分析。

热裂解条件：裂解探头起始温度为40 ℃，升温速率为10 ℃/ms，最终将温度升至300、600、900 ℃，分别保持15 s。

GC-MS条件：

色谱柱：RXI-5SiL-MS 毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度：280 ℃；载气：He 气，流速1 mL/min；分流比：100∶1；升温程序：50 ℃（2 min）280 ℃（15 min）。离子源：EI；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；四极杆温度：150 ℃；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围：50～500 amu。

采用NIST 20谱图库检索定性分析裂解产物。

1.2.3 香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）热解转移率的测定

1.2.3.1 卷烟加香

各称取3 份质量均为0.2 g 的香芹酚-β-D-葡萄糖苷和香芹酚，分别溶解于体积为5、10和20 mL 70%乙醇中，配制成质量浓度分别为40、20 和10 mg/mL的香芹酚-β-D-葡萄糖苷溶液和香芹酚溶液，用超声波辅助溶解。

（1）烟丝加香：用香精香料注射仪将体积为50 μL、质量浓度分别为40、20、10 mg/mL 的香芹酚-β-D-葡萄糖苷溶液和香芹酚溶液分别注射入空白卷烟中，得到烟丝加香量分别为2.0、1.0 和0.5 mg/支的香芹酚-β-D-葡萄糖苷或香芹酚的加香卷烟。

（2）卷烟纸加香：将50 μL 质量浓度为20 mg/mL的香芹酚-β-D-葡萄糖苷溶液或香芹酚溶液均匀涂布在卷烟纸上，得到卷烟纸加香量为1 mg/支的香芹酚-β-D-葡萄糖苷或香芹酚的加香卷烟。

采用烟丝加香和卷烟纸加香两种方式制备空白对照卷烟（只添加等量的70%乙醇）。将空白对照卷烟和加香处理过的卷烟以及剑桥滤片置于相对湿度为60%±3%、温度为（22±1）℃的恒温恒湿箱中平衡48 h。

1.2.3.2 主流烟气粒相中香芹酚转移率的测定

（1）不同加香方式分析：取空白卷烟、1 mg/支加香量的烟丝加香卷烟和卷烟纸加香卷烟，用吸烟机在标准条件（抽吸容量35 mL，每口抽吸持续时间2 s，每60 s 抽吸一口）下抽吸，每种卷烟做2 组平行，每组抽吸20 支，每张剑桥滤片捕集20 支卷烟的主流烟气粒相物。抽吸完毕后，将剑桥滤片与擦拭捕集器的脱脂棉一并放入50 mL 的锥形瓶中，加入20 mL的二氯甲烷和200 μL质量浓度为1.026 mg/mL的2,6-二氯甲苯内标溶液，超声萃取20 min 后，用微孔滤膜过滤，进行GC-MS检测。

（2）不同加香量分析：取空白卷烟及2.0、1.0 和0.5 mg/支加香量的烟丝加香卷烟，操作及测定方法同（1），进行GC-MS 检测。

（3）逐口转移率分析：取空白卷烟、1.0 mg/支加香量的烟丝加香卷烟，每张剑桥滤片分别捕集20 支卷烟的第2 至第5 口主流烟气粒相物，操作及测定方法类同（1），进行GC-MS 检测。与（1）中测定方法不同的是加入10 mL 的二氯甲烷和100 μL 质量浓度为1.026 mg/mL 的2,6-二氯甲苯内标溶液。

（4）转移率计算方法：根据下式计算香芹酚在卷烟主流烟气粒相的转移率（Y，%）［9］。

式中：M为加香后卷烟主流烟气粒相中香芹酚的质量，mg/支；M0为空白卷烟主流烟气粒相中香芹酚的质量，mg/支；Me为卷烟中添加的香芹酚的量（添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷时，则折算成香芹酚的量），mg/支。

1.2.3.3 GC-MS标准曲线绘制

称取香芹酚标准品100.63 mg，用二氯甲烷定容至100 mL。使用移液管分别移取该溶液0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00、2.00、3.00、5.00 mL 于不同的10 mL 容量瓶中，各加入200 μL 质量浓度为1.026 mg/mL 的2,6-二氯甲苯内标溶液，用二氯甲烷定容至10 mL，配制成9 个系列标准品溶液，用微孔滤膜过滤，进行GC-MS检测，绘制标准曲线。

1.2.3.4 GC-MS分析条件

色谱条件：

色谱柱：Agilent 19091S-436 HP-5ms 毛细管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；进样量：1.0µL；进样口温度280 ℃；分流比：2∶1；载气：He，流速1 mL/min；升温程序：。

质谱条件：参考文献［12］中的方法，扫描方式改为全扫描，采用NIST17 谱库检索方法进行定性分析，用内标-标准曲线法进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 化合物Ⅳ的谱图数据及结构解析

化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的结构经1H NMR、13C NMR、FTIR 和HRMS 确证，谱图解析结果如表1所示。

表1 1H NMR、13C NMR、FTIR和HRMS解析结果Tab.1 Analysis results of 1H NMR，13C NMR，FTIR，and HRMS spectra

分析1H NMR 和13C NMR 数据可知，化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的区别在于，化合物Ⅲ的氢谱上有4 个乙酰基的氢信号峰［δ=2.05（s，6H），2.03（s，3H），2.01（s，3H）］，碳谱上有4 个乙酰基的碳信号峰（CH3：δ=20.81，20.73，20.67，20.62；C=O：δ=170.82，169.75，169.56，169.20），而化合物Ⅳ的谱图上没有相应的氢信号峰和碳信号峰，证明化合物Ⅳ中不含乙酰基。

分析FTIR 数据可知，化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的区别在于，化合物Ⅲ含有1 758 cm-1和1 739 cm-1的C=O 双键伸缩振动吸收峰；化合物Ⅳ中没有相应的吸收峰，而是出现了3 429 cm-1羟基缔合状态的伸缩振动吸收峰。进一步证明，化合物Ⅳ中不含乙酰基，而是出现了羟基。

分析HRMS 数据可知，对于化合物Ⅲ，C24H32O10，计算值为498.233 4［M+NH4］+，实测值为498.233 3［M+NH4］+；对于化合物Ⅳ，C16H24O6，计算值为330.191 1［M+NH4］+，实测值为330.191 0［M+NH4］+。数据均在合理误差范围内，结合核磁共振数据，进一步证实了化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的结构。

对于化合物Ⅲ和化合物Ⅳ中的糖苷键构型，可从吡喃环上端基质子的耦合常数进行判断。化合物Ⅲ中端基质子的化学位移δ=5.13，J1，2=7.2 Hz；化合物Ⅳ中端基质子的化学位移δ=3.91，J1，2=6.0 Hz，符合规律（偶合常数J1，2=6～8 Hz，D-葡萄糖苷为β构型）。因此，化合物Ⅲ和化合物Ⅳ均为β构型。

2.2 化合物Ⅳ的热裂解分析

化合物Ⅳ在不同温度下的热裂解产物如表2 所示。可知，在300、600、900 ℃下化合物Ⅳ的主要裂解产物均为香芹酚，香芹酚峰面积分别占总裂解产物峰面积的93.68%、90.75%和66.93%。300 ℃时裂解产物的种类较少，香芹酚所占的比例较高，随着温度的升高，裂解产物的种类逐渐增多，香芹酚所占的比例逐渐减小。900 ℃时裂解产物的种类最多，裂解产物中除了香芹酚外，还有4-甲基-4-戊烯-2-醇、甲苯、苯乙烯、4-异丙基苯酚、4-甲基-2-烯丙基苯酚等化合物。

表2 不同温度条件下化合物Ⅳ的热裂解产物Tab.2 Pyrolysis products of compound Ⅳat different temperatures

2.3 GC-MS标准曲线绘制及分析结果

2.3.1 标准曲线

经GC-MS 检测后，将各标准品与内标的峰面积之比（y）与各标准品、内标的质量浓度之比（x）进行回归分析，得到标准曲线y=1.279 9x-0.195 7，标准曲线的相关系数为0.999 7，在5.031 5～503.15 μg/mL质量浓度范围内线性方程的相关性良好，可以用于定量分析。

2.3.2 GC-MS 分析结果

将香芹酚标准溶液、平衡48 h 的空白对照卷烟及添加香芹酚或香芹酚-β-D-葡萄糖苷加香卷烟的主流烟气粒相物的萃取液，按照GC-MS 实验条件进行分析，通过全扫描方式获得的总离子流色谱图见图2。通过定性分析图2 中的保留时间以及香芹酚标准品的质谱图可确定香芹酚-β-D-葡萄糖苷的糖苷键断裂生成了香芹酚。由图2a 可知，香芹酚与内标2,6-二氯甲苯的分离效果良好。由图2b 可知，未添加香芹酚或香芹酚-β-D-葡萄糖苷的空白对照卷烟主流烟气中几乎不含香芹酚。而添加香芹酚或香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟主流烟气中均生成了具有特征香味的香芹酚（图2c 和图2d），表明添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟在燃吸过程中糖苷键发生断裂生成了香芹酚。这与前面的热裂解结论一致，糖苷类化合物受热裂解生成相应的香料单体化合物。与图2c 相比，图2d 中香芹酚的离子强度较小，这可能是由于香芹酚-β-D-葡萄糖苷裂解产生的香芹酚转移至主流烟气中的量较少。

图2 卷烟主流烟气的总离子流色谱图Fig.2 Total ion flow chromatogram of mainstream cigarette smoke

2.4 主流烟气粒相中香芹酚的转移率

2.4.1 两种加香方式下香芹酚的转移率分析

将空白卷烟、1.0 mg/支加香量的烟丝加香卷烟和卷烟纸加香卷烟在标准条件下抽吸，利用GC-MS分析两种加香方式下香芹酚在主流烟气粒相中的转移率。结果表明，烟丝加香方式和卷烟纸加香方式下，添加香芹酚卷烟的主流烟气粒相中香芹酚的转移率分别为10.93%和10.04%，添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷烟的主流烟气粒相中香芹酚的转移率分别为5.12%和3.89%。即不论是在烟丝加香方式还是在卷烟纸加香方式下，添加香芹酚卷烟的主流烟气粒相中香芹酚转移率均高于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟，原因可能是在卷烟燃吸过程中香芹酚-β-D-葡萄糖苷裂解产生香芹酚的程度较小，转移到主流烟气中的量较少。

对于添加香芹酚的卷烟，烟丝加香方式下香芹酚的转移率略高于卷烟纸加香方式；对于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟，烟丝加香方式下香芹酚的转移率明显高于卷烟纸加香方式。原因可能是添加到烟丝中的香芹酚-β-D-葡萄糖苷受热裂解产生的香芹酚主要被包裹在烟丝和卷烟纸中，因此抽吸时更容易进入主流烟气；添加到卷烟纸上的香芹酚-β-D-葡萄糖苷，由于卷烟纸处在烟支的最外层，香芹酚-β-D-葡萄糖苷裂解产生的香芹酚更容易扩散到空气中，即进入侧流烟气，从而导致进入主流烟气中的量相对较少，而对于本身就易挥发的香芹酚来说，不同的加香方式对其转移率的影响相对较小。因此，以不同加香方式在卷烟中添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷，可达到不同的加香效果。

2.4.2 不同加香量对转移率和释放量的影响

在烟丝加香方式中不同加香量下，卷烟燃吸后产生的香芹酚在主流烟气粒相中的转移率和释放量如图3 所示。可知，随着香芹酚加香量的增加，主流烟气中香芹酚的释放量呈先增加后减少的趋势，可能是在加香量为0.5～1.0 mg/支时，加香量较小，随着加香量的增加，香芹酚释放量逐渐增加；在加香量为1.0～2.0 mg/支时，加香量超出气溶胶的运载能力，加上香芹酚本身的损耗和滤嘴截留，使香芹酚的释放量略有减少。而添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷烟的主流烟气中香芹酚的释放量随加香量的增加呈增大趋势，原因可能是即使添加2.0 mg/支的香芹酚-β-D-葡萄糖苷，理论上裂解成香芹酚的量为0.96 mg/支，加香量仍相对较小，因此随着加香量的增加，香芹酚的释放量逐渐增加。

图3 不同加香量下卷烟主流烟气粒相中香芹酚的转移率和释放量Fig.3 Transfer rate and release amount of carvacrol to particulate phase of mainstream cigarette smoke at different flavoring amounts

添加香芹酚卷烟的主流烟气粒相中香芹酚的转移率随加香量的增加呈下降趋势，而添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷烟的主流烟气粒相中香芹酚的转移率随加香量的增加无明显变化。对于添加香芹酚的卷烟，加香量为0.5～1.0 mg/支时，由于香芹酚本身易挥发，再加上滤嘴烟丝的截留，使香芹酚的释放量并非随着加香量的增加而呈线性增加，从而导致香芹酚的转移率下降；加香量为1.0～2.0 mg/支时，香芹酚的释放量有所下降，导致香芹酚的转移率进一步下降。对于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟，香芹酚的释放量随着加香量的增加呈线性增加的趋势，因而香芹酚的转移率基本不变。

由以上分析可知，添加香芹酚的卷烟主流烟气粒相中香芹酚的转移率随加香量的增加呈下降趋势，而对于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷烟主流烟气粒相中香芹酚的转移率，加香量的增加对其无明显影响。

2.4.3 主流烟气逐口转移率分析

在烟丝加香方式下，1.0 mg/支加香量的卷烟主流烟气中香芹酚的逐口转移率结果如图4 所示。可知，添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟主流烟气中香芹酚的逐口转移率基本一致，逐口稳定性较好，而添加香芹酚的卷烟主流烟气中香芹酚的逐口转移率随抽吸口数序号的增大呈下降趋势。表明添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟主流烟气中香芹酚的释放更加均匀、稳定。

图4 卷烟主流烟气中香芹酚的逐口转移率Fig.4 Puff-by-puff transfer rates of carvacrol to mainstream cigarette smoke

2.5 在卷烟加香中的应用分析

将空白卷烟和加香（香芹酚、香芹酚-β-D-葡萄糖苷）卷烟进行对比分析可知，与空白卷烟相比，加香卷烟的主流烟气中均生成了香芹酚，可以提供香芹酚的特征香气；添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟主流烟气中香芹酚的逐口转移率更稳定、释香更加均匀，加香效果优于香芹酚。由于香芹酚-β-D-葡萄糖苷在常温下较稳定且耐高温，因此可有效解决香芹酚常温下易挥发、加香不稳定等问题。

3 结论

（1）采用相转移催化法将乙酰溴-α-D-葡萄糖与香芹酚反应合成香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷，收率为42.5%；再在CH3ONa/CH3OH 体系中脱去乙酰基生成香芹酚-β-D-葡萄糖苷，收率为77.5%。经1H NMR、13C NMR、FTIR 和HRMS 分析确证了香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷和香芹酚-β-D-葡萄糖苷的结构。

（2）香芹酚-β-D-葡萄糖苷在300、600、900 ℃下的主要裂解产物均为香芹酚。添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟在燃吸过程中糖苷键发生断裂生成香芹酚。

（3）以不同加香方式在卷烟中添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷时，主流烟气粒相中香芹酚的转移率不同。添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟在抽吸时可在主流烟气粒相中释放香芹酚，且随着加香量的增加香芹酚释放量呈增大趋势，而在主流烟气粒相中香芹酚的转移率则较稳定。

（4）逐口转移率结果表明，在烟丝加香方式下添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟释香更均匀、稳定，释香效果优于香芹酚。