大黄素甲醚对异丙肾上腺素诱导心肌损伤的保护作用

陈琪琪 金松南

山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东 济南 250117

心肌肥厚是高血压、冠心病和瓣膜病等多种心血管疾病共同的病理改变，是心脏对持续病理性刺激产生的一种代偿反应，但长期的病理刺激会引发不可逆的失代偿和心肌损伤，进而造成心力衰竭甚至死亡［1-3］。

在心肌肥厚的病理生理学方面，交感神经过度兴奋占据着重要地位。交感神经过度兴奋诱导儿茶酚胺的分泌而刺激心脏中β-肾上腺素能受体，可以引起心肌肥厚和心力衰竭［4-5］。异丙肾上腺素（isoproterenol， ISO）为一种β-肾上腺素能受体激动剂，能够通过炎症反应、氧化应激、内质网应激和凋亡途径直接或间接地作用于心肌组织，可引起心肌肥厚和心力衰竭。目前以ISO所诱导的心肌损伤模型已在动物实验中较为广泛应用。炎症与心肌损伤有着密切关联。Toll 样受体4（toll-like receptors，TLR4）可激活核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）参与炎症和免疫反应［6］，当心肌缺血损伤时，TLR4/NF-κB通路可诱导心肌细胞凋亡［7］。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）是一种重要的炎症反应细胞因子，参与心功能紊乱［8］。TLR4/NF-κB还通过生成TNF-α 促进糖尿病心肌病的发生和发展［9］。骨髓分化蛋白88（MyD88）是一种衔接蛋白，对TLR4 至关重要，并导致炎症反应增强［10］。研究表明，ISO诱导的心功能紊乱与TLR4/MyD88/NF-κB通路介导的TNF-α生成有关［11］。

大黄素甲醚是中药大黄的生物活性成分之一。近期研究表明，大黄素甲醚具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡和脂肪分解等药理学作用［12-15］。然而，大黄素甲醚对ISO致心肌损伤是否具有保护作用目前尚不清楚。本研究旨在探讨大黄素甲醚对ISO致心肌损伤的保护作用及相关机制，为心脏病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 ISO、TAK-242（中国Selleck 公司）、普萘洛尔、MTT（美国Sigma 公司），异氟醚（中国RWD 生命科学有限公司），CK-MB 试剂（上海酶联生物科技有限公司），LDH试剂（南京建成生物工程研究所），细胞核蛋白与细胞质提取试剂（上海碧云天生物技术有限公司），DMEM 培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶、青霉素、链霉素（北京Solarbio 公司），PVDF 膜和ELC 发光试剂（美国Millipore 公司），TLR4 抗体、MyD88 抗体、NF-κB 抗体、TNF-α抗体、二抗（美国CST公司）。

1.1.2 药物 大黄素甲醚购自西安嘉天生物科技有限公司，纯度为98%。

1.1.3 实验动物 雄性SD 大鼠（200～220 g）由济南朋悦实验动物有限公司提供，实验动物许可证号为 SCXK（鲁）20190003。

1.1.4 心肌细胞系 大鼠心肌细胞（H9c2）购自上海细胞生物学研究所。

1.1.5 仪器 小动物超声心动仪（富士胶片中国投资有限公司）、多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司），CO2培养箱（日本SANYO 公司），电泳仪（美国BIORAD 公司），电泳槽（美国BIO-RAD 公司），转膜仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌肥厚模型建立 SD 大鼠适应性饲养1 周，给予颈部皮下注射ISO 建模，诱导心肌损伤，剂量5 mg/（kg·d），对照组皮下注射等量生理盐水，连续14 d。

1.2.2 动物分组与给药 大鼠随机分为对照组、ISO组、大黄素甲醚低剂量组、大黄素甲醚高剂量组、普萘洛尔组（阳性对照组）。低剂量组和高剂量组大黄素甲醚灌胃剂量分别为10、30 mg/（kg·d），普萘洛尔组灌胃剂量为10 mg/（kg·d），连续灌胃30 d，对照组用等量生理盐水灌胃。将大鼠麻醉，迅速打开胸腔。从腹主动脉抽取血液待进一步分析，切除心脏并称重。

1.2.3 心功能指标检测 大鼠吸入3%异氟醚麻醉，采用小动物超声心动仪进行心功能检测。使用Vevo 3100 系统和MX-250 探头进行左室胸骨旁短轴的M模式图像。

1.2.4 生化指标检测 从全血中分离血清，按说明书加入待测试剂和血清样品，经多功能酶标仪测定吸光度后计算血清中2种心肌激酶即肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB， CK-MB）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）水平。

1.2.5 心肌细胞培养 培养H9c2 细胞时，选用DMEM培养液，其中含10%的胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素。H9c2细胞在37℃、5% CO2培养箱中进行培养，挑选生长良好的细胞（表现为贴壁、细胞细长梭状、细胞边缘清楚、细胞内颗粒少、培养液清澈透明），等待实验。

1.2.6 细胞存活率检测 将H9c2 细胞按104/孔的密度接种到96孔板，培养24 h。用ISO孵育H9c2 细胞24 h，建立心肌细胞损伤模型。采用MTT法检测细胞存活率，检测波长为490 nm时的吸光度，计算细胞存活率，并与空白对照比较。根据ISO半数抑制浓度来确定后续实验ISO诱导H9c2细胞损伤浓度。

1.2.7 细胞分组与给药 将H9c2 细胞分为对照组、ISO模型组、大黄素甲醚组（10、30、60 nmol/L）和TAK-242（25 μmol/L）组。在ISO 损伤细胞之前，分别用大黄素甲醚和TAK-242预处理4 h。

1.2.8 蛋白印迹法 收集待检测细胞，按细胞核蛋白与细胞质提取试剂盒说明书，提取细胞核和细胞质蛋白。将蛋白样品在12% SDS-PAGE上进行电泳，随后转移到PVDF 膜上，封闭，加入一抗TLR4（稀释1∶1 000）、MyD88（稀释1∶1 000）、NF-κB（稀释1∶1 000）、TNF-α（稀释1∶1 000）和β-actin（稀释1∶1 000）于4 ℃下孵育过夜，洗涤后，加入二抗（稀释1∶1 000）于37 ℃下孵育1.5 h，用ECL 法进行化学发光。用Image J软件对蛋白表达进行定量，β-actin作为内参。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 大黄素甲醚对ISO致大鼠心肌肥厚的影响

与对照组相比，ISO 组大鼠心脏质量/体质量和左心室质量/体质量比值显著升高；与ISO 组相比，大黄素甲醚低剂量组、高剂量组以及普萘洛尔组大鼠心脏重/体重和左心室重/体重比值显著降低；ELISA 结果显示，与对照组相比，ISO 组大鼠血清CK-MB 和LDH 水平均显著升高；与ISO 组相比，大黄素甲醚低剂量组、高剂量组和普萘洛尔组大鼠血清CK-MB 和LDH 水平均显著降低，差异有统计学意义（P＜ 0.001）。（表1）。

表1 大黄素甲醚对ISO致大鼠心肌肥厚的影响（n = 6）

2.2 大黄素甲醚对ISO致心功能紊乱的影响

超声心动图结果显示，与对照组相比，ISO组大鼠心功能指标即EF 和FS 均显著降低；与ISO 组相比，大黄素甲醚低剂量组、高剂量组和普萘洛尔组大鼠EF 和FS 均显著升高，差异均有统计学意义，（P＜ 0.001）（表2）。

表2 大黄素甲醚对ISO致大鼠心功能紊乱的影响（n = 6）

2.3 大黄素甲醚对ISO致心肌细胞损伤的影响

与对照组相比，ISO（200 ～ 400 μmol/L）显著降低H9c2 细胞存活率。当ISO 浓度为350 μmol/L 时，H9c2细胞存活率达到52.99%，故选取350 μmol/L作为后续实验的ISO 损伤浓度。由大黄素甲醚在0 ～300 nmol/L浓度范围内无H9c2细胞毒性（表3）。大黄素甲醚10、30、60 nmol/L 和TAK-242 25 μmol/L 均能抑制ISO致H9c2细胞存活率的下调及LDH水平的升高（表4）。

表3 ISO、大黄素甲醚对H9c2细胞存活率的影响（n = 6）

表4 大黄素甲醚对ISO致H9c2细胞损伤的影响（n = 6）

2.4 大黄素甲醚对ISO致H9c2细胞损伤时TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达的影响

为进一步探讨大黄素甲醚对ISO致心肌损伤的保护作用机制，采用蛋白印迹法检测了H9c2 细胞中炎症信号通路相关蛋白表达。如图1 所示，与对照组相比，ISO 损伤组H9c2 细胞TLR4（图1A）、MyD88（图1B）、胞浆NF-κB（图1C）、胞核NF-κB（图1D）和TNF-α（图1E）蛋白水平显著增加，差异均有统计学意义（P＜ 0.05），而大黄素甲醚和TAK-242干预均剂量依赖性下调上述蛋白表达。

图 1 大黄素甲醚对ISO致H9c2细胞损伤时TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达的影响

3 讨 论

心脏病是全世界死亡人数最高的疾病之一，近年来其发病率呈逐年上升趋势。相比于急速增长的患病率，目前尚缺乏有效的治疗药物，因此迫切需要开发治疗心脏病的新药物。交感神经过度兴奋与心肌损伤密切关联［4-5］。因此，本研究选用β-肾上腺素能受体激动剂ISO分别建立大鼠心肌肥厚模型，通过体内和体外实验探讨了大黄素甲醚对ISO致心肌损伤的保护作用及机制。本研究结果显示，在ISO 诱导的大鼠心肌肥厚模型中，大黄素甲醚降低心脏质量指数，下调血清中CK-MB 和LDH 水平，并改善心功能指标如EF 和FS，提示大黄素甲醚对ISO诱导的大鼠心肌肥厚具有保护作用。在体外实验中，使用ISO 致H9c2 心肌细胞损伤的模型，发现大黄素甲醚能有效抑制ISO 诱导的心肌细胞损伤，其表现为维持细胞存活率，减少LDH 的释放，并显著抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路，进而减少细胞炎症因子TNF-α的释放，提示大黄素甲醚通过调节炎症反应发挥其对ISO 致心肌细胞损伤的保护作用。

CK-MB和LDH是临床上2种重要的心肌酶，两者主要存在于心肌细胞的胞浆和线粒体中，当心肌受损时，此2 种酶大量外漏，血液中水平明显增加［16-17］。因此血清中CK-MB 和LDH 水平与心肌损伤程度呈正相关，可反映心肌损伤程度。当ISO 破坏细胞脂质膜时，过量的CK-MB和LDH释放进入血液［18］。本研究结果显示，大黄素甲醚明显抑制ISO致心肌损伤大鼠血清CK-MB和LDH水平的升高，表明大黄素甲醚能够抑制ISO诱导的大鼠心肌损伤。

Toll 样受体在细胞表面分布十分广泛，是一类天然免疫受体，可以通过直接识别、结合高度保守的特定分子结构，并引发一系列信号转导，进而导致炎性递质的释放，在炎症和免疫反应中发挥重要的作用［6］。TLR4是Toll 样受体的主要成员之一，其在心脏的表达最高，在心肌炎、心肌梗死、缺血再灌注损伤等心血管疾病的心肌炎症过程中起着关键性的作用［19-21］。MyD88是一种衔接蛋白，对TLR4至关重要，并导致炎症反应增强［10］。既往研究证实，当心肌损伤时TLR4 通过MyD88 依赖途径激活NFκB 信号传导，从而增加下游的促炎因子 TNF-α 释放，造成心肌收缩功能障碍而导致心功能紊乱［11］。NF-κB是一种核转录因子，穿梭于胞浆和胞核之间，其在炎性疾病中的作用显得尤为重要。本研究结果显示，大黄素甲醚显著抑制ISO 诱导的胞浆及胞核NF-κB 蛋白表达升高，表明其能减弱ISO 致NFκB 信号激活，揭示了大黄素甲醚通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，减少炎症因子TNF-α的释放，从而发挥其对ISO 致心肌损伤的保护作用。这为深入理解大黄素甲醚抗心肌损伤的分子机制提供新的视角。

本研究通过大鼠体内实验，比较了大黄素甲醚与常用心肌保护药物普萘洛尔在ISO 致心肌损伤中的保护作用，大黄素甲醚对大鼠心肌损伤的保护作用类似于普萘洛尔的作用，提示大黄素甲醚可能是一种新的天然心肌保护剂，而其临床效应仍需要进一步的研究证实。

综上所述，大黄素甲醚通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，降低细胞炎症因子TNF-α水平，发挥其对交感神经过度兴奋所致心肌损伤的保护作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突