一种快速测定虾青素含量的方法

周 凡，屈 云，谭家声，张亚娟

(湖北省兴发磷化工研究院有限公司，湖北 宜昌 443007)

虾青素亦称虾黄素，是一种酮式类胡萝卜素，广泛存在于生物界中，具有很强的抑制肿瘤发生和生长，抗氧化，抵御紫外线，增强人体免疫功能，改善视力、色素形成和神经连通以及改善生育等作用，特别是抗氧化作用超强，被誉为“超级抗氧化剂”。研究发现，很多种类的藻类都含有虾青素。其中，雨生红球藻生产虾青素具有细胞繁殖快、培养简单、易于提取的特点，且藻粉可直接应用于食品及饲料工业，降低成本，是目前公认生产天然虾青素最好的生物来源。

目前，检测虾青素含量的方法主要有分光光度法和液相色谱法[1-4]。因国内更多企业对于虾青素的测定方法更注重简便、快捷、经济等因素，故本文采用分光光度法测定虾青素含量，通过单因素实验比较了不同溶剂的提取效果，选择了最佳提取溶剂二甲基亚砜，并对比了用二甲基亚砜做提取溶剂测定雨生红球藻粉和含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素含量的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

7200型可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；ME-204E电子天平(梅特勒托利多)；Milli-Q超纯水仪(Millipore)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司) ；Cenlee 16R台式冷冻离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)；RE-5299旋转蒸发器(青岛明博环保科技有限公司)；UltiMate3000液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司)。

虾青素标准品(BWRM，BW1827-20mg，纯度98.2%)，具有不同虾青素含量的雨生红球藻粉(山东金晶生物技术有限公司)，磷酸盐(食品级，兴发集团湖北省兴发磷化工研究院有限公司)，碳酸氢钠(食品级，湖南银桥食品添加剂有限公司)，柠檬酸钠(食品级，大自然生物集团有限公司)，食盐(食品级，湖南省湘盐化有限责任公司)，甲醇、无水乙醇、丙酮、二甲基亚砜、石油醚、二氯甲烷、叔丁基甲基醚，均为分析纯，磷酸、氢氧化钠为优级纯，天津科密欧公司，水为超纯水。

1.2 检测方法

1.2.1 提取溶剂的选取

用天平称取5份虾青素质量分数约为2%的雨生红球藻粉，放入 25 mL 的试管中。将 10 mL 的乙醇、丙酮、二甲基亚砜、石油醚、二氯甲烷分别加入到5个试管中。在常温下提取 1 h 后，将溶液进行旋蒸干燥，分别加入 10 mL 的二甲基亚砜溶液。将溶液置于分光光度计中 (吸收波长 489 nm) 测定吸光度。

1.2.2 绘制虾青素标准曲线

用二甲基亚砜作为溶剂，虾青素标准品为溶质，配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL 的标准溶液，用 1 cm 比色皿在分光光度计上 489 nm 处测定吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.3 样本溶液的制备

实验样本是虾青素质量分数分别约为2%、3%、4%、5%的雨生红球藻粉原料Ⅰ、原料Ⅱ、原料Ⅲ、原料Ⅳ和雨生红球藻粉(虾青素质量分数约为2%)与磷酸盐、碳酸氢钠、柠檬酸钠、食盐分别按质量比1∶9配成的复配产品Ⅰ、复配产品Ⅱ、复配产品Ⅲ、复配产品Ⅳ。

精密称取样品0.1～1 g(精确至 0.0001 g)左右于 50 mL 洁净干燥的离心管中，使用 50 mL 二甲基亚砜少量多次萃取，直至样品中无色素，每次倒入萃取溶剂后于50～52 ℃ 恒温水浴锅中至少静置 10 min，分别固液分离，然后合并萃取液，再向合并的萃取液中加入二甲基亚砜定容 100 mL，避光静置，测定所获得溶液在 489 nm 处的吸光度值，计算样品中虾青素的质量分数。

1.2.4 回收率试验

以雨生红球藻粉原料Ⅰ和复配产品Ⅰ，同时进行虾青素三水平加标回收测定，测定虾青素回收率。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选取

从图1看出，5种不同溶剂对于虾青素的提取效果差异明显，其中二甲基亚砜溶液的提取效果最佳，所以选择二甲基亚砜溶液为最宜提取溶剂。

图1 不同溶剂的提取效果

2.2 虾青素标准曲线图

在最大吸收波长 489 nm 处测得虾青素各质量浓度标准溶液的吸光度值 (如图2所示) ，以吸光度值为纵坐标，虾青素质量浓度为横坐标绘制标准曲线。二甲基亚砜溶液中虾青素质量浓度和吸光度之间的关系式为y=0.1657x+0.0087，R2=0.9997，线性关系良好。

图2 虾青素标准曲线

2.3 虾青素含量测定结果对比

分别用本方法和GB/T 31520—2015 《红球藻中虾青素的测定液相色谱法》测定雨生红球藻粉Ⅰ和含雨生红球藻粉的复配产品Ⅰ中虾青素含量。从表1看出，本方法与国标法比较，测定雨生红球藻粉中虾青素含量的误差为0.02%～0.09%，测定含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素含量的误差为0.003%～0.011%。此方法能快速且准确测定雨生红球藻粉和含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素的含量。

表1 虾青素含量测定结果对比

2.4 虾青素回收率测定结果

从表2看出，雨生红球藻粉中虾青素平均加标回收率为98.7%，含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素平均加标回收率为98.3%。

表2 虾青素回收率测定结果

3 结论

本文利用虾青素易溶于有机溶剂的特点，通过溶剂筛选选择出最佳提取溶剂二甲基亚砜，在最大吸收波长 489 nm 处利用分光光度法对雨生红球藻粉及含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素含量进行测定，其标准曲线回归方程的R2是0.9997，线性关系良好。本方法与GB/T 31520—2015比较，测定雨生红球藻粉中虾青素含量的误差为0.02%～0.09%，测定含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素含量的误差为0.003%～0.011%。且用本方法雨生红球藻粉中虾青素平均加标回收率为98.7%，含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素平均加标回收率为98.3%。本方法能用于雨生红球藻粉及含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素含量定量分析，方法操作简单、快速、不需要特别昂贵的检测仪器，能够满足企业快速定量检测雨生红球藻粉及含雨生红球藻粉的复配产品中虾青素含量的需要。