HPLC-ELSD法同时测定电子烟烟液中的10种甜味剂

叶智莲，杨文武，况利平

(深圳市吉迩科技有限公司喜马拉雅实验室，广东 深圳 518000)

电子烟是指用于产生气溶胶供人抽吸的电子传输系统[1]。电子烟烟液是配合电子烟烟具使用的雾化物，主要化学成分有烟碱、丙二醇、丙三醇及各类香精香料，不同风味的烟液成分十分复杂[2-3]。甜味剂的应用促进了电子烟水果口味的发展，受到广大电子烟消费者的追捧[4]。为了克服单一甜味剂的局限性，一般采用甜味剂复配，起到增强甜味和风味，弥补或掩蔽不良口味的作用[5]。甜味剂用量过大，电子烟烟液在雾化过程中会容易出现“糊味”，这与甜味剂的分子量大小、甜味剂纯度、雾化温度、雾化芯材料及结构等因素相关[6]。合理使用甜味剂是安全的，不会对消费者的健康产生风险，但超限量、超范围，或者使用劣质的人工合成甜味剂，会对消费者的身体健康产生一定的负面影响[7-8]。过度摄入可能会出现皮肤问题、情绪波动、呼吸不畅，导致头痛、癫痫、过敏等症状[9]。甜味剂经过电子烟烟具雾化后产生的气溶胶比传统食品等经口摄入方式更为复杂，因此甜味剂的选择、使用剂量的安全检测评估极为必要。

甜味剂的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法、离子色谱法、液相色谱-质谱法和气相色谱法等[10]。目前，电子烟烟液中多种甜味剂的检测主要采取高效液相色谱串联质谱法，如廖惠云等[11]采用SPE-HPLC-MS/MS同时测定电子烟烟液中9种甜味剂；杨飞等[12]采用UPLC-MS/MS同时测定电子烟烟液中安赛蜜等5种合成甜味剂。液相色谱串联质谱仪方法的仪器昂贵、维护成本高。HPLC-ELSD不需要化合物具有发色团或者荧光基团的光学特性，适用领域广，方法操作简单，分析时间短，灵敏度高。本研究建立电子烟烟液中常用甜味剂的检测方法，为电子烟中甜味剂复配和风味开发提供技术支持，同时适用于对电子烟烟液中甜味剂的批量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

11款不同水果口味的电子烟烟液(均购自国外市场)，编号为：Y1—Y11，其中Y1、Y2为草莓香蕉味；Y3、Y4为蓝莓树莓味；Y5、Y6为草莓味；Y7、Y8为富士苹果味；Y9为蓝莓覆盆子柠檬味；Y10为桃子味；Y11为西瓜味。

安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、爱德万甜(纯度≥98%，上海安谱实验科技股份有限公司)；阿力甜、纽甜、新甲基橙皮苷二氢查尔酮(纯度≥98%，坛墨质检科技股份有限公司)；罗汉果苷V(纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司)；甲醇、乙腈(HPLC级，坛墨质检科技股份有限公司)；甲酸、三乙胺、乙酸铵(HPLC级，上海安谱实验科技股份有限公司)；试验用水为实验室自制超纯水。

1.2 仪器设备

高效液相色谱仪(LC-2050C 3D) (日本岛津公司)；蒸发光散射检测器(ELSD-16) (日本岛津公司)；氮气发生器(上海析维医疗科技有限公司)；电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；超声波清洗仪(深圳洁盟技术股份有限公司)；高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

混合标准储备液的配制：分别精密称取安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿力甜、纽甜、阿斯巴甜、NHDC、爱德万甜、罗汉果苷V各 100 mg，置于 10 mL 容量瓶中。用50%甲醇水定容至刻度线，得到各甜味剂质量浓度均为 10 mg/mL 的混合标准储备液。

混合标准工作溶液的配制：分别移取混合标准储备液5、10、25、50、100、250 μL 至6个 10 mL 的容量瓶中，用50%甲醇水稀释并定容，制得不同质量浓度的标准工作溶液。标准工作溶液中10种甜味剂的质量浓度分别均为5、10、25、50、100、250 mg/L。

1.3.2 样品前处理

精密称取 0.5 g 样品于 10 mL 容量瓶中，加入50%甲醇水定容至刻度线，涡旋振荡混匀，超声 20 min，高速离心后，提取液经 0.22 μm 滤膜过滤，取续滤液分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：HPLC column Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm；5 μm)或者等效柱；柱温：35 ℃；进样量：15 μL；流速：1 mL/min；流动相A：0.1%甲酸水(用三乙胺调pH=4.5)；流动相B：甲醇；洗脱梯度：0～5 min 80%A，5～10 min 50%A，10～25 min 25%，25～26 min 80%A，26～30 min 80%A。ELSD检测器：漂移管温度：40 ℃；载气流量：3.00 L/min；压力：0.375 MPa；雾化气体：氮气。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的确定

通过调整流动相流速和配比来优化10种甜味剂的分离度。当流速为 1 mL/min，按照上述洗脱梯度，可以使10种甜味剂得到很好的分离，并且可以有效避开电子烟烟液的干扰峰和磺胺类甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素)的特征峰，得到较为满意的分离度，如图1、图2所示。

1.安赛蜜；2.糖精钠；3.甜蜜素；4.三氯蔗糖；5.阿斯巴甜；6.阿力甜；7.新甲基橙皮苷二氢查尔酮；8.爱德万甜；9.罗汉果苷V；10.纽甜。

1.安赛蜜；2.糖精钠；3.甜蜜素；4.三氯蔗糖；5.阿斯巴甜；6.阿力甜；7.新甲基橙皮苷二氢查尔酮；8.爱德万甜；9.罗汉果苷V；10.纽甜。

2.2 流动相的确定

实验考察了甲醇、乙腈作为流动相有机相的差异，用乙腈作为有机相，易导致出峰时间相近的两个组分共同流出，分离效果不佳，因此选择甲醇作为有机相。通过不同水相的选择，改变流动相体系，考察不同流动相体系对分离效果的影响，对比了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 乙酸铵、甲醇-5 mmol/L 乙酸铵(含0.1%甲酸)等不同体系下目标化合物的色谱峰强度、峰形和分离效果。结果表明：以水作为水相时，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素不出峰，可能与三种化合物均呈碱性有关，容易在C18柱上吸附，难以洗脱，而且纽甜的峰形矮胖。以甲醇-5 mmol/L 乙酸铵、甲醇-5 mmol/L 乙酸铵(含0.1%甲酸)作为水相时，甜蜜素均出现拖尾现象且峰形矮胖；安赛蜜、糖精钠的分离度变差。为了延长色谱柱的使用寿命，减少铵盐的使用，本研究对0.1%甲酸水进行pH值调试进而改善峰形、色谱峰强度和分离度；分别将0.1%甲酸水的pH值用三乙胺调节成3.0、4.0、4.5、5.0、7.5，随着pH值升高，安赛蜜作为第一个出峰的物质，出峰时间从 3.5 min 推移到 4.8 min，当pH值升至4.5后，甜蜜素的拖尾现象得到完全解决，三氯蔗糖和阿斯巴甜、爱德万甜和罗汉果苷V得到很好的分离效果，而且多种甜味剂的色谱峰强度达到最高，见图3。因此，确定甲醇-0.1%甲酸水溶液(pH=4.5)作为流动相，10种甜味剂得到很好的分离效果，并且可以跟电子烟烟液的其他杂质峰、3种磺胺类甜味剂的特征峰完全分离，10种甜味剂混合标准溶液色谱图见图1。

图3 流动相pH值对目标化合物色谱峰强度的影响

2.3 ELSD检测器参数的确定

影响ELSD的主要参数有漂移管温度和载气流量。参照ELSD-16型号的使用要求，进气口最大压力≤0.5 MPa，调节氮气发生器的阀门，使氮气的压力在推荐使用范围0.35～0.4 MPa 之间，调节至 0.375 MPa。ELSD中漂移管的温度设置在30～80 ℃ 之间，可以根据流动相的成分而定。漂移管温度设置低时，流动相得不到充分挥发，背景噪声增加；漂移管温度设置过高时，流动相沸腾，背景噪声也会增加，同时可能会造成部分热敏性物质的分解或挥发。通过调整载气流量分别为2.5、3.0、3.5 L/min 和漂移管温度分别为35、40、45、50 ℃。实验表明，载气流量和漂移管温度对组分的保留时间基本没有影响，选择载气流量为 3.0 L/min 和漂移管温度为 40 ℃ 时，噪声小、灵敏度高、色谱图基线平稳，满足实验要求。

2.4 标准曲线、线性范围和检出限

在1.3.3条件下，将配制的系列标准溶液分别进样 15 μL 进行分析测试，以峰面积为纵坐标，以标准溶液的质量浓度为横坐标，绘制二次曲线，即：y=ax2+bx+c。以信噪比(S/N)为3时的进样质量浓度为各种甜味剂的检出限(LOD)，以信噪比(S/N)为10时的进样质量浓度为各种甜味剂的定量限(LOQ)。结果表明，各种甜味剂在5～250 mg/L 的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.998，可以满足定量分析的要求，见表1。

表1 10种甜味剂的标准工作曲线、相关系数、检出限和定量限

2.5 方法准确度和精密度

选取一款在售的电子烟烟液，通过对样品进行加标回收来验证方法的准确度。分别进行低、中、高三水平的加标实验，每个水平进行重复测试6次，计算样品中各种甜味剂的回收率和RSD，通过回收率和RSD评价该方法的准确度和精密度，结果见表2。回收率在90.0%～110.0%，RSD在0.774%～7.65%，表明该方法有较好的准确度和重复性，能够满足测试需求。

表2 不同质量浓度下10种甜味剂的加标回收与精密度试验

2.6 样品实测分析

对市场上11款不同口味的电子烟烟液进行2次平行实验，结果见表3。常应用于电子烟的甜味剂有三氯蔗糖、纽甜等，含量一般在0.5%以下，其它类型的甜味剂应用较少，可能与样本量较少、三氯蔗糖和纽甜的甜度、风味较好相关。甜味剂复配可能带来多种风味，并且创造新颖的口感，以满足不同消费者的需求。

表3 11款电子烟样品中甜味剂含量的测定结果 ρ/(mg·g-1)

3 结论

建立了HPLC-ELSD同时测定电子烟烟液中的安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、新甲基橙皮苷二氢查尔酮、爱德万甜、罗汉果苷V、纽甜的检测方法。10种甜味剂在5～250 mg/L 范围内线性良好，相关系数高于0.998，回收率在90.0%～110.0%，RSD在0.774%～7.65%，具有良好的重现性和稳定性。该方法实验步骤简单、分析时间短，改善了部分标准方法中只能满足单种或者几种甜味剂检测的不足，为电子烟烟液中甜味剂的筛查和检测提供了准确、可靠的分析方法，能够满足实验室的日常检测需求。