民族药灯盏花药材及其混淆品的指纹图谱研究*

晏润文，蒲 芬，2，余 涛，2，黄艳敏，2，徐士奎**，罗艳秋

(1.云南省食品药品监督检验研究院，工业和信息化部产业技术基础公共服务平台，云南 昆明 650106；2.大理大学 药学院，云南 大理 671000；3.云南中医药大学，云南 昆明 650500)

灯盏花为菊科飞蓬属植物短葶飞蓬(Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.)的干燥全草[1]，又名灯盏细辛，为西南特色民族药之一。灯盏花用药历史悠久，在《滇南本草》 《晶珠本草》 《藏药志》等文献均有记载。现代药理研究表明，灯盏花具有改善心脑血管缺血、抗炎、改善微循环、抑制血小板聚集、神经保护等药理活性[2-3]。近年来，由于野生资源匮乏，药农或民族医生常将形态相似及地理分布区重叠的近缘种混淆灯盏花采挖售卖或在临床使用。前期对云南、四川等地民间灯盏花使用情况及其混淆品进行调研与文献研究，发现目前混淆品主要有多舌飞蓬、展苞飞蓬、密毛紫菀、一年蓬等多种植物[4-6]。调研中发现，商品市场与临床应用的灯盏花药材规格较多，不仅有全草入药者，也有地上部分入药者，甚至出现以灯盏花乙素为主的专属性栽培药材；而藏医药体系常将多种飞蓬属和紫菀属植物不加区分以头状花序入药[7-9]，其中包括灯盏花。这些问题的普遍存在，给灯盏花药材临床疗效和用药安全带来巨大隐患与挑战。

中药指纹图谱基于对中药多成分协同作用认识及化学成分的系统研究，具有信息量大、专属性强、整体性等特点，被国内外广泛认可与使用[10]。近年来，有一些文献对灯盏花药材及其近缘种开展了指纹图谱研究[11-14]，但多基于对全草的分析。为揭示灯盏花药材及其混淆品不同药用部位的差异，本研究采用UPLC建立灯盏花质量评价的指纹图谱，并对正品与混淆品的全草、不同药用部位等进行比较研究，发现质量变化的内在规律及不同民族用药经验差异的内在物质基础，为灯盏花药材质量评价、产业发展、监督检验等提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Ultimate3000超高效液相色谱仪、二极管阵列检测器(赛默飞世尔科技有限公司)，SQP型十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，CPX5800H-C型超声清洗机(雅马拓科技贸易有限公司)，ELGA超纯水机(法国威立雅水务公司)。

1.2 材料

野黄芩苷对照品(纯度：92.1%，批号：110842-202010)购自中国食品药品检定研究院；灯盏花甲素对照品(纯度：98.83%，批号：08S-YIM-97-5)购自PANPHY化学品公司。甲醇、乙腈、甲酸等购自德国Merck公司。

共收集灯盏花药材12批次，野外实地采集混淆品5批次，所有样品均经云南省食品药品监督检验研究院徐士奎副主任药师鉴定，实验材料见表1。所有样品粉碎，过4号筛，备用。

表1 灯盏花及其混淆品实验材料信息表

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称定野黄芩苷、灯盏花甲素对照品适量，加入甲醇溶解，制备质量浓度为0.10499、0.09488 mg/mL 的对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

精密称取 0.5 g 的灯盏花药材粉末于锥形瓶中，加入 50 mL 50%甲醇溶液，常温超声 30 min，过滤，于 50 mL 容量瓶中定容，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plius C18(φ2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱，以0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0～3.5 min，5%B→5%B；3.5～8 min，5%B→8%B；8～13 min，8%B→9%B；13～14 min，9%B→12%B；14～16 min，12%B→14%B；16～27 min，14%B→15%B；27～33 min，15%B→17%B；33～35 min，17%B→17%B；35～38 min，17%B→25%B；38～43 min，25%B→40%B；43～48 min，40%B→90%B；48～52 min，90%B→90%B，均为体积分数)，流速为 0.2 mL/min，柱温 40 ℃，进样量为 2 μL，300 nm 波长下检测。

2.4 方法学考察

1)专属性试验。取空白溶液、混合对照品溶液、供试品溶液(S1)依次进样，进行专属性考察。结果显示，空白溶剂无干扰，对照品峰形好，分离度高，专属性良好。

2)精密度试验。取供试品溶液(S1)，连续进样6次，以野黄芩苷色谱峰(9号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对保留面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别在0.52%、1.82%以内，表明仪器精密度良好。

3)重复性试验。取灯盏花药材粉末(S1)，平行制备6份供试品溶液，分别进样，以野黄芩苷色谱峰(9号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对保留面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别在0.23%、2.76%以内，表明该方法重复性良好。

4)稳定性试验。取供试品溶液(S1)，于0、2、8、12、16、20、24 h 时分别进样，以野黄芩苷色谱峰(9号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对保留面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别在1.93%、3.02%以内，表明该方法稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

1)灯盏花指纹图谱建立。12批栽培灯盏花药材按“2.2”项方法制备供试品溶液，以2.3节色谱条件进样测定。将各批次灯盏花色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，通过多点校正和自动峰匹配，建立共有峰指纹图谱，生成灯盏花对照图谱。以S1为参照图谱，建立了灯盏花指纹图谱叠加图和对照图谱(图1、图2)。共标定19个共有峰，通过与对照品图谱对照，确认9号峰为野黄芩苷，13号峰为灯盏花甲素。12批灯盏花药材相似度较高，均大于0.893，说明灯盏花药材质量较稳定，其化学成分具有良好的一致性(表2)。

图1 12批灯盏花UPLC指纹图谱叠加图

表2 12批灯盏花与对照图谱的相似度

2)灯盏花不同药用部位指纹图谱建立。分别选择10批药材构建灯盏花不同药用部位(叶、茎、花)指纹图谱，茎、叶、花不同药用部位指纹图谱叠加图和对照图谱见图3。茎、叶、花分别标定17、20、19个共有峰，将灯盏花不同药用部位对照品图谱与全草对照图谱比较，结果发现，茎、叶与全草对照图谱无明显差异，化学成分组成类似。花与全草对照图谱有一定差异，41～47 min 内的色谱峰可将花与其他药用部位有效区分。相似度结果显示，灯盏花药材茎、叶、花的相似度分别大于等于0.945、0.876、0.948，表明同部位各批次间化学组成相似(表3)。

(a)茎部指纹图谱叠加图 (b)叶部指纹图谱叠加图

表3 不同药用部位与对照图谱的相似度

3)混淆品不同药用部位UPLC指纹图谱研究。按“2.2”项方法制备5种混淆品的供试品溶液，以2.3节色谱条件进样测定，采集的色谱数据与灯盏花对照图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，进行相似度评价。通过比较混淆品与灯盏花的对照图谱可知，狭苞紫菀、一年蓬、石生紫菀与灯盏花的整体峰形具有较大差异，展苞飞蓬、多舌飞蓬与灯盏花的整体峰形较为相似，但灯盏花存在其特有的色谱峰(图4)。因此，该指纹图谱方法可对灯盏花及其混淆品加以鉴别。从相似度结果来看，展苞飞蓬、多舌飞蓬与灯盏花的相似度较高，多舌飞蓬、展苞飞蓬、狭苞紫菀、一年蓬和灯盏花花部的相似度较高(表4)，这在一定程度上解释了在藏医药体系中多种飞蓬属与紫菀属植物混用的情况(以头状花序入药)。

a：灯盏花；b：多舌飞蓬；c：展苞飞蓬；d：狭苞紫菀；e：一年蓬；f：石生紫菀。

表4 混淆品与灯盏花对照图谱相似度分析

3 讨论

试验比较了流动相水-乙腈中不同甲酸体积分数(0、0.05%、0.1%)、不同流速(0.1、0.2、0.3 mL/min)、不同检测波长(290、300、325、335 nm)下各色谱峰的峰形、峰数、响应值和分离度，结果表明，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相，在 0.2 mL/min 的流速和 300 nm 波长下进行分析所得色谱峰的整体分离效果和峰形较佳。通过比较不同的提取方法(冷浸 2 d、65 ℃ 加热回流 2 h、常温超声 30 min)、不同提取时间(超声20、30、40、50 min)、不同提取溶剂(40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇)对提取效率和提取效果的影响，结果表明，以50%甲醇、常温超声 30 min 的提取效率和效果较佳。

12批灯盏花UPLC指纹图谱共标定19个共有峰，相似度均大于0.893，可知其药材质量较为稳定。该方法可用于灯盏花药材质量控制。通过对不同药用部位对照图谱比较，发现茎、叶与灯盏花全草对照图谱无明显差异，化学成分组成类似，但与花部对照图谱差异较为显著。建立的指纹图谱通过比较特征色谱峰，可有效鉴别灯盏花及其混淆品。展苞飞蓬、多舌飞蓬的整体峰形与灯盏花较为相似，且相似度较高。与肖琳婧等[11]研究结果不同，说明不同产地、生长环境、采收时间等因素对混淆品质量影响较大，应增加样本数量、充分考虑不同因素对混淆品质量的影响，才能全面评估混淆品的利用价值。多舌飞蓬、展苞飞蓬、狭苞紫菀、一年蓬与灯盏花药材花部相似度较高，化学成分较为相近，揭示了藏医药体系中多种飞蓬属与紫菀属植物以头状花序入药混用的物质基础。

本研究运用指纹图谱对灯盏花药材和混淆品化学成分组成进行分析，并比较不同药用部位化学成分差异，可为灯盏花药材质量控制、鉴别和使用提供参考。