IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA表达与肾病预后不良的关系分析

廖敏 宋勇波 魏卓 刘小兵 程魁 范哲奇 双松涛 祝存海

（孝感市中心医院泌尿外科，武汉科技大学附属孝感医院，孝感 432100）

免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）肾病是以肾小球系膜区IgA沉积为特征的慢性肾病，发病率占原发性肾小球疾病的20%～45%［1］。IgA肾病呈慢性进展性，目前尚无特异性治疗方法，临床常根据患者临床表现和肾脏病变程度给予长疗程多药联合治疗，以修复肾脏损伤、抑制肾脏异常免疫反应从而延缓病情发展，但仍有部分患者最终进展为终末期肾病，威胁其生命健康［2］。因此，探讨影响IgA肾病患者预后不良的影响因素对预防该病进展、改善预后有重要意义。肾小球系膜细胞过度增殖、细胞外基质过度沉积是导致肾小球疾病进展的核心病理环节［3］，而P21、P27是与细胞增殖密切相关的细胞周期调控因子，能抑制G1期和S期的细胞周期素与细胞周期激酶（cyclin dependent kinase，CDK）结合，抑制细胞增殖，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是脱氧核糖核酸（DNA）多聚酶的一种辅助蛋白，能够反映细胞增殖活性，既往研究发现P21、P27、PCNA在肾病中表达异常，参与了肾系膜细胞的增殖过程［4-5］。但以上指标在IgA肾病患者中的表达及其与肾脏预后不良的关系尚不明确。鉴于此，本研究采用免疫组化法检测IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA的表达，并探讨其与肾脏预后不良的关系，旨在为其临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入标准：均行肾穿刺活检，且病理结果证实为IgA肾病；年龄≥18岁；均对本研究知情并签署同意书。排除标准：乙肝病毒、过敏性紫癜、系统性红斑狼疮相关性肾炎等继发性IgA肾病；有肾移植史的患者；肾穿刺活检标本镜下肾小球数＜8个；合并糖尿病肾病、膜性肾病、间质性肾炎等肾病患者；其他合并糖尿病、心脑血管疾病、血液系统疾病及恶性肿瘤患者。按纳入、排除标准选取2017年4月至2019年8月孝感市中心医院收治的145例IgA肾病患者作为研究对象，其中男83例，女62例；年龄21～60岁，平均（39.54±7.78）岁；病理表现：系膜细胞增生74例、毛细血管内皮细胞增生7例、节段性肾小球硬化86例、肾小管萎缩29例、新月体54例。

1.2 方法

1.2.1 治疗与随访 依据《原发性IgA肾病诊治循证指南（2016）》［6］，针对患者病情和肾脏病变程度进行治疗，合并持续性肉眼血尿（持续2～4周及以上）患者给予甲泼尼龙冲击治疗，15～30 mg/（kg·d），3～5 d为1个疗程，治疗1～2个疗程；合并蛋白尿患者结合肾脏病理结果给予血管紧张素转化酶抑制剂（ace inhibitors，ACEI）、血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin-receptor blockade，ARB）、免疫抑制剂治疗；新月体形成患者给予激素联合环磷酰胺治疗6个月，前3～5 d给予甲泼尼龙15～30 mg/（kg·d）冲击治疗，后续口服泼尼松15～30 mg/（kg·d），同时环磷酰胺每月0.5 g/m2冲击治疗；另针对合并高血压、高血脂、凝血异常等患者给予降压（当肾功能正常或轻微受损时给予ACEI/ARB降压，当肾功能受损严重、Scr＞440 μmol/L时给予钙拮抗剂降压）、调脂、抗凝等治疗。

以病理确诊日期为随访起点，所有患者均随访24个月，将肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）较基线值下降超过50%或进展至终末期［eGFR＜15 ml/min·（1.73 m2）］的患者归为预后不良组，其余患者归为预后良好组，其中eGFR=186×Scr-1.154×年龄-0.203×（0.742女性）。

1.2.2 临床指标检测 收集所有患者年龄、性别、病理表现、血压及24 h尿蛋白、血肌酐（serum creatinine,Scr）、白蛋白（albumin,ALB）、尿酸（uric acid,UA）、胆固醇（TC）、三酰甘油（triacylglycerol,TG）等实验室指标，所有临床指标均为肾活检前最后一次晨起空腹检测结果。

1.2.3 肾小球阳性和阴性细胞检测 收集所有患者肾穿刺活检组织，采用甲醛-醋酸-乙醇固定液固定，经脱水、透明、石蜡包埋制成石蜡切片。切片经烘烤、脱蜡水化后用3%过氧化氢（H2O2）室温孵育10 min灭活H2O2酶活性。磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，P21、P27组织切片微波进行抗原修复（PCNA无须进行）；滴加牛血清蛋白进行封闭，室温孵育20 min后用PBS清洗；滴加适当比例稀释的一抗试剂，室温孵育1 h，PBS清洗3次；滴加二抗，室温孵育10 min，PBS清洗3次；再滴加链亲和素-过氧化物酶复合物，室温孵育10 min，PBS清洗3次后用二氨基联苯胺显色，待显色后用苏木素复染，冲洗后用盐酸乙醇分色，脱水透明后封片。结果判读：在高倍镜（×200倍）下阅片，核显示黄色或棕褐色为阳性，蓝色为阴性，计数每个肾小球阳性和阴性细胞，阳性率（%）=阳性核数/（阴性核数+阳性核数）×100%，取所有肾小球的平均值作为该切片的表达指标。

1.3 统计学分析 采用SPSS25.0软件分析数据，计量资料若符合正态分布以±s描述，采用t检验；计量资料若不符合正态分布则采用M（Q1，Q3）描述，采用Mann-Whitney U检验；计数资料以“%”描述，采用χ2检验；并采用Logistic多元回归分析IgA肾病患者预后不良的影响因素。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA的表达 IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA阳性细胞表达率分别为（38.69±6.83）%、（55.94±8.08）%、（33.47±5.72）%，见图1。

图1 IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA表达Fig.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with IgA nephropathy

2.2 IgA肾病患者预后不良情况及不同预后患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA的表达 随访结束时，145例IgA患者中预后不良者25例，预后良好者120例，预后不良发生率为17.24%（25/145）。预后不良组肾小球系膜组织P21、PCNA阳性细胞表达率均高于预后良好组（P＜0.05），P27阳性细胞表达率低于预后良好组（P＜0.05），见表1、图2。

表1 不同预后患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA的表达（±s，%）Tab.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with different prognosis （±s，%）

表1 不同预后患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA的表达（±s，%）Tab.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with different prognosis （±s，%）

Groups Poor prognosis（n=25）Good prognosis（n=120）t P P21 48.69±8.72 36.57±5.83 8.605＜0.001 P27 51.64±9.43 56.85±7.24 3.103 0.002 PCNA 44.17±7.62 31.20±4.06 12.180＜0.001

图2 肾小球系膜组织P21、P27、PCNA表达Fig.2 Expression of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue

2.3 IgA肾病不同预后患者一般资料比较 预后不良组舒张压、24 h蛋白尿、节段性肾小球硬化占比、肾小管萎缩/间质纤维化占比、新月体占比均高于预后良好组（P＜0.05），见表2。

表2 IgA肾病不同预后患者一般资料比较Tab.2 Comparison of prognosis of patients with IgA nephropathy

2.4 IgA肾病患者预后不良的影响因素 经Logistic多元回归分析，舒张压升高、24 h蛋白尿增多、系膜细胞增生、节段性肾小球硬化、肾小管萎缩/间质纤维化、新月体与P21、PCNA阳性表达率升高、P27阳性细胞表达率降低均是影响IgA肾病患者预后不良的危险因素（P＜0.05），见表3。

表3 Logistic多元回归分析Tab.3 Logistic multiple regression analysis

3 讨论

IgA肾病发病机制尚未完全明确，近年来研究发现IgA1对肾小球系膜细胞具有亲和力，能够特异性结合诱导细胞增殖，引发肾小球炎症反应进而损伤肾小球［7］。有研究显示约1/3的IgA肾病患者肾损伤呈进行性加重，最终导致预后不良［8］。本研究145例IgA肾病患者仅随访24个月预后不良发生率高达17.24%，证实了IgA肾病预后不良的高风险，故亟须探讨影响IgA肾病预后不良的因素以指导临床干预，改善预后。

本研究结果显示，IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA阳性细胞表达率分别为（38.69±6.83）%、（55.94±8.08）%、（33.47±5.72）%，提示P21、P27、PCNA可能在IgA肾病的发生发展中发挥一定作用。IgA肾病以IgA免疫复合物沉积于系膜区，诱发肾小球系膜细胞增生及系膜基质堆积为主要特征，肾小球系膜的增生与系膜细胞过度增殖有关，而细胞增殖必须经历完整的细胞周期，受细胞周期调控因子的调控［9］。PCNA是在细胞增殖中呈阶段性表达的一种蛋白，与DNA聚合酶结合引导DNA复制，可有效反映细胞的增殖活性，既往研究报道IgA肾病小鼠PCNA水平相较健康对照组升高，且此类小鼠系膜细胞增殖增强，提示PCNA可能与肾系膜细胞增殖关系密切［10］。P21、P27是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）家族中的成员，能够抑制多数细胞周期素和CDK复合物，使细胞不能通过G1期到S期之间的检验点，停滞在G1期；另外，P21可与PCNA结合抑制DNA复制，进而抑制细胞增殖［11-12］。正常情况下P21处于低表达水平，P27处于高表达水平来抑制细胞增殖，而在肾小球系膜组织中P21表达上调、P27表达下调则提示抑制肾系膜细胞增殖能力减弱，进而参与IgA肾病的发生。此外，本研究结果显示IgA肾病预后不良组肾小球系膜组织P21、PCNA阳性细胞表达率均高于预后良好组，P27阳性细胞表达率低于预后良好组，经多因素分析显示其均是IgA肾病预后不良的危险因素。肾小球系膜细胞增殖是IgA肾病的重要病理机制，也是病情进展的重要原因。PCNA是细胞增殖活性的指标，而P27是抑制细胞增殖的因子，PCNA表达增加，P27表达减少说明肾小球系膜细胞增殖增多，促进IgA肾病进展。P21可与CDK复合物结合抑制细胞增殖，但P21参与足细胞的损伤，当足细胞在增殖表型状态下P21可从复合物中分离，变为游离状态［13］，因此在肾小球硬化过程中随着足细胞增生，P21同样作为抑制细胞增殖的因子表达增加。另外焦素敏等［14］发现P21表达水平与肾小球硬化呈正相关，进一步证实了P21表达增加与IgA肾病进展相关，是导致其预后不良的危险因素。且目前已有动物实验通过在肾炎小鼠中调控P21、P27的表达来抑制细胞增殖来干预肾病进展，改善预后［15］。本研究结果还显示，舒张压升高、24 h蛋白尿增多、系膜细胞增生、节段性肾小球硬化、肾小管萎缩/间质纤维化、新月体均是影响IgA肾病预后不良的危险因素，与既往研究报道一致［16-18］。

综上，P21、P27、PCNA在IgA肾病肾小球系膜组织中均存在阳性细胞表达，预后不良患者P21、PCNA阳性细胞表达率高于预后良好者，P27阳性细胞表达率低于预后良好者，且均是IgA肾病患者预后不良的危险因素。