白藜芦醇通过调节SIRT1/AMPK信号通路介导自噬反应对膝关节骨性关节炎大鼠细胞凋亡的影响

张磊 赵敏 （武汉市中医医院骨科，武汉 430000）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨性关节炎中的常见类型，影响患者美观与身体健康，加重患者经济负担［1］。软骨细胞的过度凋亡是KOA的发病机制之一，自噬可通过上调促进氧自由基促进细胞凋亡［2-3］。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activated protein kinase，AMPK）是自噬相关通路，从抑制软骨细胞凋亡角度出发探寻治疗药物是KOA的潜在治疗手段［4］。白藜芦醇属多酚化合物，在抗肿瘤、预防动脉粥样硬化等方面发挥作用。研究显示，其在兔膝骨关节炎中具有保护作用［5］。此外白藜芦醇可调节多种细胞、动物模型的自噬［6-7］。本研究构建KOA损伤大鼠模型，探讨白藜芦醇基于SIRT1/AMPK信号通路介导的自噬途径对KOA损伤大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级Wistar大鼠［体质量200～250 g，SCXK（湘）20190015］购自长沙天勤生物技术有限公司；弗氏完全佐剂（FCA，S30541）、白藜芦醇（S30630）购自上海源叶生物科技有限公司；SIRT1抑制剂EX527（HY-15452）、自噬激活剂雷帕霉素（HY-10219）购自MedChemExpress公司；大鼠IL-6 ELISA试剂盒（ml102828）、大鼠肿瘤坏死因子β（TNF-β）ELISA试剂盒（ml002953）购自上海酶联生物科技有限公司；HE染色试剂盒（C0105S）、TUNEL细胞凋亡试剂盒（显色法，C1091）、蛋白提取试剂盒（P0033）、BCA试剂盒（P0012S）购自上海碧云天生物技术有限公司；SIRT1（GT1189）、AMPK（GTX01105）、p-AMPK（GTX50224）、Beclin-1（GTX133555）、LC3B/A（GTX39752）、GAPDH（GTX100118）购自GeneTex公司；山羊抗兔二抗（ab6721）购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 50只健康Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、白藜芦醇组、白藜芦醇+SIRT1抑制剂组、自噬激活剂组，每组10只。除对照组外，其余组别大鼠均参考文献［8］复制KOA模型，即将大鼠右膝周围毛发剃除，乙醇消毒，第1、3、7天于膝关节处注射0.1 ml FCA，大鼠出现膝关节红肿、僵硬、行动受限代表造模成功，成功造模大鼠40只，造模成功率100%，对照组于第1、3、7天膝关节注射等量生理盐水。造模结束后白藜芦醇组大鼠鞘内注射10 μmol/kg白藜芦醇［5］、白藜芦醇+SIRT1抑制剂组注射10 μmol/kg白藜芦醇与10 mg/kg EX527［9］，自噬激活剂组大鼠鞘内注射2 mg/kg自噬激活剂雷帕霉素［10］，1次/d，连续28 d，模型组和对照组注射等量生理盐水，1次/d，连续28 d。

1.2.2 膝骨关节炎严重程度评估 给药后观察大鼠Lequesne MG膝关节级别［11］。局部疼痛刺激反应分为4级。步态观察分为4级。关节活动范围分为4级。关节肿胀分为3级。

1.2.3 关节液炎症标志物水平测定 给药结束后，向膝关节注入生理盐水，反复回抽，得到的液体离心取上清，于-20 ℃保存备用。使用ELISA试剂盒检测大鼠关节液IL-6、TNF-β水平。

1.2.4 HE染色、TUNEL染色观察膝关节软骨组织形态及凋亡情况 处死大鼠，骨刀离断大鼠双侧膝关节，仔细取出股骨端与胫骨端关节，4%多聚甲醛固定，EDTA脱钙（10%，每2 d更换），脱钙完成后流水冲洗，切开膝关节，取股骨内踝关节软骨组织，制备为0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm组织块，标记、脱水、石蜡包埋，切片，HE试剂盒染色，光镜下观察软骨组织形态；TUNEL细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。凋亡率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 透射电子显微镜观察软骨细胞自噬情况取1 cm3左右软骨组织，戊二醛内固定，4 h后PBS清洗，锇酸后固定，乙醇脱水（30%、50%各15 min），环氧树脂包埋后进行超薄切片（70 nm），醋酸铀与枸橼酸钠染色，透射电镜观察细胞自噬情况。

1.2.6 Western blot法检测SIRT1、AMPK、Beclin-1、LC3B/A蛋白表达 取一定量软骨组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取一定量样品SDS-PAGE凝胶电泳处理，将蛋白转膜，封闭（5%脱脂奶粉），加入一抗（SIRT1、AMPK、p-AMPK、Beclin-1、LC3B/A，稀释比分别为1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶100；GAPDH（内参）按1∶5 000的比例稀释，4 ℃下孵育过夜，添加羊抗鼠二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL显色，计算目的条带与内参条带的灰度比，分析SIRT1、AMPK、p-AMPK、Beclin-1、LC3B/A的相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行数据分析，计量数据以±s表示，两组间的比较采用t检验（对照组、模型组；白藜芦醇组、白藜芦醇+SIRT1抑制剂组），多组间比较采用F检验（模型组、白藜芦醇组、自噬激活剂组），进一步两两统计学比较采用SNK-q法。N描述等级资料，秩和检验进行组间比较。P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Lequesne MG评估情况 与对照组相比，模型组局部反应、步态反应、关节活动、关节肿胀程度加重（P＜0.05）；与模型组相比，白藜芦醇组、自噬激活剂组局部反应、步态反应、关节活动、关节肿胀程度减轻（P＜0.05）。见表1。

表1 治疗后组间Lequesne MG评估结果Tab.1 Evaluation results of Lequesne MG between groups after treatment

2.2 白藜芦醇对大鼠膝关节关节液炎症的影响与对照组相比，模型组大鼠膝关节液IL-6、TNF-β水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，白藜芦醇组、自噬激活剂组大鼠膝关节液IL-6、TNF-β水平降低（P＜0.05）；与白藜芦醇组相比，白藜芦醇+SIRT1抑制剂组大鼠膝关节液IL-6、TNF-β水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠膝关节关节液炎症水平情况（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Inflammatory level of knee joint fluid of rats in each group （±s， n=10， pg/ml）

表2 各组大鼠膝关节关节液炎症水平情况（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Inflammatory level of knee joint fluid of rats in each group （±s， n=10， pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with resveratrol group， 3）P＜0.05.

TNF-β 12.43±1.53 43.76±5.461）31.57±3.922）39.52±4.953）41.24±5.162）Groups Control Model Resveratrol Resveratrol+SIRT1 inhibitor Autophagy activator IL-6 21.50±2.61 79.54±9.721）51.26±6.372）62.80±7.763）48.76±6.012）

2.3 白藜芦醇对大鼠膝关节软骨组织形态的影响 对照组大鼠软骨表面光滑，排列整齐，结构清晰，着色均匀，细胞核呈蓝色，胞浆为粉红色；模型组大鼠软骨组织细胞排列紊乱，粗糙，存在纤维化变性、软骨下骨硬化、边缘有丘状隆起；白藜芦醇组、自噬激活剂组较模型组相比细胞排列紊乱、边缘丘状隆起等现象有改善；与白藜芦醇组相比，白藜芦醇+SIRT1抑制剂组细胞排列紊乱、边缘丘状隆起等现象又有加重。见图1。

图1 软骨细胞结构观察HE染色图（×100）Fig.1 HE staining of chondrocyte structure （×100）

2.4 白藜芦醇对大鼠膝关节软骨组织细胞凋亡的影响 与对照组［（4.32±0.54）%］相比，模型组大鼠软骨细胞凋亡率［（22.54±2.80）%］升高（P＜0.05）；与模型组相比，白藜芦醇组［（13.46±1.66）%］、自噬激活剂组［（12.17±1.51）%］大鼠软骨细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与白藜芦醇相比，白藜芦醇+SIRT1抑制剂组［（18.53±2.32）%］大鼠软骨细胞凋亡率升高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠膝关节软骨细胞凋亡TUNEL染色图（×400）Fig.2 TUNEL staining of chondrocyte apoptosis in knee joint of rats in each group （×400）

2.5 白藜芦醇对大鼠膝关节软骨组织细胞自噬的影响 对照组细胞结构完整，胞质内可见完整细胞器，可见少量双层膜的自噬小体；模型组细胞细胞器减少，可见空泡变性，自噬小体数目增多；与模型组相比，白藜芦醇组、自噬激活剂组自噬小体数目增多；与白藜芦醇组相比，白藜芦醇+SIRT1抑制剂组细胞自噬小体数目减少。见图3。

图3 各组大鼠膝关节软骨细胞自噬情况（×8 000）Fig.3 Autophagy of chondrocytes in knee joint of rats in each group （×8 000）

2.6 白藜芦醇对大鼠膝关节软骨组织SIRT1、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白的影响 与对照组相比，模型组大鼠膝关节软骨组织SIRT1、p-AMPK/AMPK降低（P＜0.05），Beclin-1和LC3-B/A表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，白藜芦醇组、自噬激活剂组大鼠膝关节软骨组织SIRT1、p-AMPK/AMPK、Beclin-1和LC3-B/LC3-A表达显著升高（P＜0.05）；与白藜芦醇组相比，白藜芦醇+SIRT1抑制剂组大鼠膝关节软骨组织SIRT1、p-AMPK/AMPK、Beclin-1和LC3B/A表达降低（P＜0.05）。见表3、图4。

图4 各组大鼠膝关节软骨组织SIRT1、p-AMPK、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白Western blot图Fig.4 Western blot of SIRT1， p-AMPK， AMPK， Beclin-1 and LC3-B/A proteins in knee cartilage of rats in each group

表3 各组大鼠膝关节软骨组织SIRT1、p-AMPK、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白表达（±s，n=10）Tab.3 Protein expressions of SIRT1， p-AMPK， AMPK， Beclin-1 and LC3-B/A in knee cartilage of rats in each group（±s， n=10）

表3 各组大鼠膝关节软骨组织SIRT1、p-AMPK、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白表达（±s，n=10）Tab.3 Protein expressions of SIRT1， p-AMPK， AMPK， Beclin-1 and LC3-B/A in knee cartilage of rats in each group（±s， n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with resveratrol group， 3）P＜0.05.

LC3-B/A 0.15±0.02 0.65±0.081）0.89±0.112）0.71±0.083）1.52±0.192）Groups Control Model Resveratrol Resveratrol+SIRT1 inhibitor Autophagy activator SIRT1/GAPDH 1.24±0.15 0.54±0.061）0.92±0.112）0.68±0.083）0.89±0.112）p-AMPK/AMPK 0.94±0.12 0.51±0.061）0.73±0.092）0.66±0.083）0.69±0.082）Beclin-1/GAPDH 0.42±0.05 0.60±0.071）1.04±0.132）0.82±0.093）1.35±0.162）

3 讨论

KOA是膝关节的退行性疾病，发病机制涉及关节软骨细胞合成失调，细胞外基质分泌异常等，其中软骨细胞凋亡在KOA中发挥关键作用［12］。生理状态下，软骨细胞凋亡、增殖趋于平衡，正常水平的凋亡对软骨的形态完整、成熟有维持作用，但在外界应激的病理状态下，细胞通过自噬来避免细胞凋亡，但应激长期不清除，自噬不足导致软骨细胞凋亡过度，细胞外基质合成较少，软骨细胞凋亡进一步增加，形成恶性循环，加重膝关节的结构与功能损伤。ZHANG等［13］研究显示，骨性关节炎软骨细胞中关键自噬基因减少、凋亡增加，mTOR可通过增加自噬降低软骨细胞凋亡以及滑膜纤维化。本研究将基于自噬从抑制膝关节软骨细胞凋亡角度找寻KOA的治疗药物。

本研究采用FCA注射法构建大鼠KOA模型，所构建模型膝关节明显红肿、变粗，病理切片显示有炎症浸润、新生血管，结构紊乱，提示所构建的KOA模型关节损伤严重，可用于后续研究。白藜芦醇是一种多酚类化合物，具有抗炎等多种生物学活性，白藜芦醇通过激活自噬和抑制SIRT1/AMPK信号通路介导的细胞凋亡来保护脊髓免受损伤［14］；白藜芦醇可通过调控自噬影响破骨细胞的分化［15］。此外，白藜芦醇在控制粥样硬化、蛛网膜下腔出血等疾病防控中发挥作用［16-17］。本研究中经白藜芦醇治疗的KOA大鼠较KOA模型大鼠软骨细胞退化减轻，形态趋向完整，局部反应、步态反应、关节活动、关节肿胀程度分级降低，同时膝关节液IL-6、TNF-β水平降低，TUNEL染色证实软骨细胞凋亡减少，提示白藜芦醇能够抑制KOA大鼠软骨细胞凋亡，缓解病情，可能是KOA有效治疗药物之一，但治疗机制尚不明确。

SIRT1与延缓细胞衰老、调节氧化应激、能量代谢等多种细胞功能有关。MA等［18］研究显示，SIRT1可直接调节自噬相关分子Atg5/Atg7/LC3乙酰化水平参与细胞自噬反应。AMPK高度保守，作为AMP的能量传感器存在于真核细胞中对自噬起正调节作用，AMPK与SIRT1可互相调控。自噬与炎症、细胞凋亡关系密切，炎症因子通过与细胞质膜的特异性受体结合可调节自噬过程，自噬可抑制炎症因子过程［19］；17β-雌二醇通过SIRT1介导的AMPK信号通路诱导线粒体自噬上调以保护软骨细胞，进而达到治疗骨关节炎的作用［20］。本研究中，KOA大鼠自噬水平升高，表现为自噬小体数目增多，LC3-B/A、Beclin-1水平升高，白藜芦醇处理后，自噬水平进一步升高，提示KOA大鼠自噬不足可能是致病机理之一，白藜芦醇可通过促进自噬抑制软骨细胞的凋亡，且白藜芦醇处理大鼠SIRT1、AMPK水平均升高，提示白藜芦醇促进自噬抑制软骨细胞凋亡的可能机制是介导SIRT1/AMPK通路引起的。为此本研究分别添加在白藜芦醇治疗KOA模型大鼠基础上添加AMPK抑制剂，发现白藜芦醇对KOA的炎症、凋亡缓解作用可被部分逆转，即白藜芦醇可能是通过激活SIRT1/AMPK通路促进自噬抑制软骨细胞凋亡，进而缓解KOA症状。

综上所述，白藜芦醇可能通过激活SIRT1/AMPK通路促进自噬抑制KOA大鼠软骨细胞凋亡，为KOA的治疗药物选择提供了理论依据。但本研究仍存在一定不足，白藜芦醇与SIRT1/AMPK的具体调控机制仍需进一步探讨。