基于UPLC-MS对七叶一枝花不同部位化学成分的比较分析

2024-04-09陈炬烽熊长华周建金林燕华

中国民族民间医药·下半月 2024年2期

陈炬烽　熊长华　周建金　林燕华

【摘要】目的：比较分析重楼属植物七叶一枝花的不同组织部位（叶片、茎秆、根茎、根）中化学成分的差异，科学合理开发药用资源。方法：采用超高效液相和质谱联用技术，结合代谢组学的方法，鉴定不同组织部位化学成分，检测相对含量的大小，探讨各类有机化合物的组成比例和分布规律。结果：七叶一枝花不同组织部位中共检测出63种化合物，含9中甾体皂苷类，其余为萜类化合物和萜类，化合物成分在叶片、茎秆、根茎中的的相对含量和分布规律存明显差异，采用主成分分析，能对不同组织器官进行直观的鉴定区分。结论：液质联用技术在中药的质量分析和品质控制上具有较好的指导意义，结合代谢组学的分析方法，在样品的分类鉴定上优势明显，数据结果也表明七叶一枝花在药用资源的开发利用上具有较好的前景。

【关键词】七叶一枝花；超高效液相；液质联用；化学分析；重楼皂苷

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）04-0018-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.04.zgmzmjyyzz202404005

Comparative Analysis of Chemical Constituents of Paris polphylla Smith var. chinensis Franch based on UPLC-MS

CHEN Jufeng1 XIAONG Changhua2 ZHOU Jianjin3 LIN Yanhua1*

Abstract：Objective Compare and analyze the differences of chemical components in different tissue parts （leaves， stems， rhizomes and roots） of Paris polphylla Smith var. chinensis Franch of Paris， in order to scientifically and reasonably develop medicinal resources.Methods The chemical components of different tissues and parts were identified by ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry combined with metabonomics， and the relative content was measured to explore the composition and distribution of various organic compounds.Results A total of 63 compounds were detected in different tissues and parts of Paris polphylla Smith var. chinensis Franch， including 9 steroid saponins， and the rest were terpenes and terpenes. The relative content and distribution of the compounds in leaves， stems， and rhizomes were significantly different. The principal component analysis can be used to visually identify and distinguish different tissues and organs.Conclusion The LC-MS technology has a good guiding significance in the quality analysis and quality control of traditional Chinese medicine. Combined with the analytical method of metabolomics， it has obvious advantages in the classification and identification of samples. The experimental results also show that the Paris polphylla Smith var. chinensis Franch has a good prospect in the development and utilization of medicinal resources.

Key words：Paris polphylla Smith var. chinensis Hara; Ultra High Performance Liquid Phase; LC-MS; Chemical Analysis; Paris Polyphylla Saponin

七葉一枝花Paris polyphylla Smith var. chinenisi （Franch）Hara是中药重楼的基源植物之一，为多年生草本，药用部位为根茎，其味苦，性微寒，具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功效［1］，是著名中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁等的主要组成成分，受到广泛关注。

现已从重楼植物中分离鉴定出五十余种化合物，其中主要有效成分为甾体皂苷，约占总化合物数目的80％［2-3］，并含有氨基酸、甾酮、蜕皮激素、黄酮苷等化合物［4］，药典中规定了重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ这三种成分的总含量不得少于0.60%，实际上重楼植物的其他组织部位同样含有丰富的皂苷类化合物，并呈现丰富的药理学活性［5］。现有文献主要是根据其中的药典规定的几种甾体皂苷进行比较分析［6］，并不能全面地反映化学成分的差异。为了合理的药用资源开发，本文在液质联用技术的基础上，以皂苷类和萜类为目标物，对重楼植物的不同组织部位（叶、茎、根茎、根）的成分进行鉴定和定量分析，系统地比较了重楼植物不同组织部位各类成分的分布特征和相对含量差异，可以对七叶一枝花植物的不同组织器官进行质量评价，同时也为重楼属植物的资源开发利用提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 2022年8月，在福建省三明市宁化安远镇永跃村，采取7年生七叶一枝花的根茎、根、茎杆和叶片组织，每三株样品作为一个生物学重复，重复3次。

1.2 仪器与试剂日本岛津UPLC液质联用色谱仪（包括二元高压泵），超高效液相色谱（UPLC;Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串联质谱（MS/MS;Applied Biosystems 6500 QTRAP）。色譜柱：Agilent SB-C18，2.1 mm×100 mm， 1.8 μm。甲醇、乙腈、异丙醇为色谱纯（德国默克），甲酸铵为分析纯（上海化学试剂厂），水为纯化水。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液的制备将样品放置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥；在液氮环境下，采用研磨仪研磨成细粉（频率30 Hz，研磨时间1.5 min），取约0.5 g，精密称定，置离心管中，加70%甲醇2.0 mL，涡旋5 min，然后将充分溶解混匀的样品连同离心管一起置冷冻离心机中离心（转速10000 g，温度：4 ℃，10 min），然后吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤样品，保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.3.2 色谱条件及质谱条件的选择流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入0.1%的甲酸），进行梯度洗脱（初始条件 B相比例为5%，9.00 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；）。流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度550°C；离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和气帘气（CUR）分别设置为50、60和25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。通过进一步的去簇电压（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE。

根据色谱中不同保留时间内的洗脱物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对，同时监测正离子模式和负离子模式，得到样品的MRM模式多峰图，如图1。基于本地代谢数据库（武汉迈维代谢公司自建的数据库），对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。图中每个不同颜色的色谱峰代表检测到的一个化合物。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度（CPS），用MultiQuant软件进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积（Area）代表对应物质的相对含量，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。

2 结果

2.1 七叶一枝花不同组织部位中化合物成分分析根据质谱分析的实验结果，在七叶一枝花的不同的组织部位中，共鉴定了63种化合物成分，包含9种甾体类皂苷和54种萜类，详细结果见表1。

2.2 七叶一枝花甾体皂苷类成分分析甾体皂苷类具有显著的药理学活性，也是中药重楼的药用价值的物质基础，七叶一枝花中的甾体皂苷主要是各种结构的重楼皂苷，从表1的结果可以看出，七叶一枝花中的甾体皂苷主要集中在根茎部位，其次是根、茎叶。具体含量数据统计如图2所示。

根茎中含量最高的重楼皂苷H，在总提取物中占比25%以上，其次是重楼皂苷VI，占比12%以上；根、茎秆部位的甾体类成分组成和根茎类似，但相对含量逐渐变低。叶片中有很多重楼皂苷类成分未检出（相对含量低于0.01%），主要的甾体皂苷成分为重楼皂苷B、重楼皂苷C或E（重楼皂苷E和重楼皂苷C是同分异构体，难以区分），叶片中的这两类甾体皂苷，在根茎和根中含量极低。这也表明，根和茎中的甾体皂苷类，主要在根茎中代谢合成，并相互存在植物生长发育中的营养输送关联，而叶中的甾体皂苷类成分和根茎中的甾体皂苷，物质结构和类型不同，代谢途径也不同，和根茎中的皂苷类关联性较小。

2.3 七叶一枝花萜类化合物分析从样品的检测结果看，七叶一枝花不同组织部位也检测出大量的萜类化合物，包含单帖、倍半萜、二萜和三萜类等。此类化合物本身具有一定的药理活性，在七叶一枝花中，也是合成重楼皂苷的前体化合物。

根茎中相对含量最高的是：7-O-coumaroyl-loganic acid（含香豆素结构的有机酸），相对含量占比10%以上，叶、茎中相对含量较高的主要有：14-hydro-15-ethoxyajugaptin（一种甾醇类化合物），相对含量在50%左右。其次，根中含量最高的是曼宋酮类，相对含量21%左右，以上这些成分均是和植物生理代谢相关的化合物，其中甾醇类是植物细胞膜结构的主要物质组成，曼宋酮类化合物可以抑制土壤中微生物对植物的侵害，是根系里面保护作用的成分；同时，这类成分也具有一定的药理活性，如曼宋酮类化合物具有抗菌、抗微生物、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等［7-8］，甾醇类调节心脑血管类功能等［9］。

其次，七叶一枝花的不同组织部位中，也检出丰富的京尼平苷，尤其是叶中，相对含量达到4%。京尼平苷对消化系统、心血管系统和中枢神经系统疾病均有显著疗效，京尼平苷还有一定的抗炎和治疗软组织损伤的作用［10］。以上实验结果，对叶片组织的开发应用提供了物质基础。

七叶一枝花不同部位也检出了熊果酸、齐墩果酸、松香酸等类似结构萜类化合物，此类成分的药理活性也比较明显，和皂苷类化合物共同组成了重楼植物的药用价值的物理基础。由于这些化合物的结构比较类似，物质解析结果的准确性存在一定的偏差，但能大致反映重楼七叶一枝花中包含大量此类结构化合物的信息。

2.4 七叶一枝花不同组织部位化学成分的主成分分析基于数据库分析的液质联用技术，能较大范围内筛查出待测目标物种的各类化合物成分，它不仅是代谢组学常用分析方法，也广泛应用于目标物的基源鉴定和分类。其基本原理就是采用数学方法对大量的数据进行统计分析。其中主成分分析是常用的分析手段。

主成分分析（principal component analysis， PCA）是一种无监督模式识别的多维数据统计方法，PCA通过降维处理，在最大程度保留原始信息的基礎上，把所有的数据投影到几个维度上，从而用低维信息来反映原始高维数据的特征。通过这种方式，来观察数据的质量和分布，以及组间组内样品的异同，进而寻找决定这种异同背后的因素。实验中采用R软件（www.r-project.org/）对数据进行处理，设置prcomp函数参数scale=True，表示对数据进行UV（unit variance scaling）处理，为了对七叶一枝花中的化合物成分进行整体的鉴定和分类，基础数据来源于化合物组成和相对含量，也包含质控样品（四类样品的等比例混合物）的数据。建模分析结果PCA分析的得分图如图3所示。

通过上图可以发现，七叶一枝花中茎的成分和根茎的成分相对较近，和根、叶的成分差异较大，这也基本反映了植物生理代谢化合物在植物体内的输送过程。其次，同类型样品之间，化合物组成和含量在主成分图上的区域相对集中，也反映了植物代谢成分的相对稳定性和一致性。

根据以上分析方法建立的模型，可以对新的样品进行类别判定，在同样的方法学条件下，如果数据结果在得分图上的距离较为接近可以判定为同一类样品，这对于不同产地的七叶一枝花化合物成分的比较分析具有参考意义。

3 讨论

根据以上的数据分析，确定七叶一枝花样品中，除了含有丰富的三萜类化合物，还包含各种生物活性的有机酸类、皂苷类，这类成分在不同器官组织部位的含量分布差异明显，通过统计学分析，可以快速地鉴别区分。其中药理活性重楼皂苷，主要分布在根茎部位。其次，液质联用的方法，结合代谢组学的统计算法，可以准确的分析检测样品中大量目标化合物信息，对于寻找新药源、品质鉴定和资源开发有指导意义。

研究通过液质联用技术对比分析七叶一枝花不同部位中药中化合物成分，结合数据库数据，鉴定出样品中63种化学物质，初步确定了不同样品中特征成分的差异和相对含量，为中药资源的开发鉴定提供了参考。同时，根据液质联用的分析方法结合数据统计学分析，对样品中大量物质（离子对）信息进行综合判断，可以对样品的类型、基源进行判定，或对近源的物种进行聚类，可以作为物质鉴定、产地判定的依据［11-13］。

药典中的重楼药材的含量测定方法中，前处理溶剂是乙醇，目标化合物是重楼皂苷类成分，实验中的前处理方法是采用70%甲醇，极性更高，提取出来的成分更为丰富、复杂，但重楼皂苷类成分不一定能充分提取，例如实验中也发现有部分重楼皂苷类未检出（低于方法的检测限），所以实验中得到的重楼皂苷相对含量仅作为参考，不代表植物中的真实含量，但实验中得到的总皂苷含量，基本能反应植物不同组织器官中化合物的分布规律，对资源的开发利用能提供有意义的参考。

从检测的结果看，七叶一枝花的主要药理活性成分集中在根茎部位，这也是重楼植物药用部位的物质基础，根系部位和茎杆组织的成分也较为丰富，但甾体类化合物（重楼皂苷类）的含量相对较低，药理活性偏弱，其次也发现，在七叶一枝花的叶片组织中，化合物成分具有相对独立性，不能代替根茎部位用药，但其中存在特异性化合物，也具有药用开发价值。

参考文献

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