氯沙坦通过IRE1-TRAF2-ASK1-JNK信号通路调节高糖诱导的血管平滑肌细胞的增殖、凋亡和迁移

于文会 张岩 臧亚茹 段书众

(承德医学院附属医院 1药学部,河北 承德 067000;2肾脏内科)

心血管疾病是糖尿病患者死亡和发病的主要原因,尤其是动脉粥样硬化,因糖尿病患者的血管平滑肌细胞(VSMCs)受损而引发〔1〕。高血糖可促进VSMCs增殖和迁移并抑制其凋亡,导致VSMCs在血管内膜中积累,引起动脉粥样硬化斑块在血管内壁的沉积,并诱导内膜增厚、血管重塑〔2〕。因此防止高糖诱导的VSMCs迁移、增殖并提高凋亡,可能是糖尿病性血管病有希望的治疗方案。氯沙坦(LT)是一种血管紧张素受体阻滞剂,除了降低血压外,它还具有多种公认的治疗效果如抗炎、抗纤维化等〔3〕。研究发现LT可以抑制VSMCs中血管紧张素Ⅱ诱导的细胞增殖〔4〕,但能否改善VSMCs受损尚不可知。研究发现内质网应激信号通路参与调控VSMCs表型转化、转分化、凋亡,从而参与动脉粥样硬化、高血压、动脉瘤及血管钙化形成〔5〕,因此内质网应激机制被认为是治疗血管性疾病的靶点,而肌醇需求酶(IRE)1-肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)2-凋亡信号调节激酶(ASK)1-c-Jun N末端激酶(JNK)信号通路是内质网应激发挥作用的主要信号通路〔6〕。本研究旨在探讨LT能否通过IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路调节高糖诱导的VSMCs增殖、凋亡和迁移。

1 材料与方法

1.1动物来源 广州中医药大学提供雄性、清洁级Sprague-Dawley大鼠,5周龄,体质量118～125 g,动物许可证号:SCXK(粤)2019-0047。所有程序按照医院动物护理和使用委员会制定的指南进行,且该指南符合ARRIVE动物研究指南。

1.2主要材料、仪器 LT(武汉浩荣生物科技有限公司);细胞计数试剂盒(CCK)-8(北京索莱宝科技有限公司);Transwell小室(Corning公司);IRE1α激动剂-毒胡萝卜素(TG,Santa Cruz公司);膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司);Abcam公司提供IRE1、TRAF2、磷酸化(p)-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK一抗。FACS Calibur流式细胞仪(BD公司);荧光显微镜(Olympus公司);BIO-RAD 680型全自动酶标仪(美国伯乐公司)。

1.3细胞分离及鉴定 首先将戊巴比妥钠麻醉大鼠,然后脱颈处死大鼠,分离出整个胸主动脉,之后纵向切开胸主动脉,用无菌弯头镊子去除内皮细胞,小心剥离血管外膜,将主动脉组织切成1 mm3小块,加入胶原酶在37 ℃、5%CO2培养箱中消化主动脉组织,之后细胞利用胰蛋白酶消化并进行常规培养,并通过α-平滑肌动蛋白(SMA)抗体免疫荧光鉴定VSMCs,用于后续实验。

1.4细胞分组 取对数生长期VSMCs,并分组为:空白组、高糖组,同时在高糖组的基础上设置高糖+LT组、高糖+TG组、高糖+LT+TG组。其中空白组未经任何处理;高糖组采用25 mmol/L葡萄糖处理〔7〕;高糖+TG组采用25 mmol/L葡萄糖处理前0.5 h先加入0.2 nmol/L IRE1α激动剂-TG处理〔8〕;高糖+LT组采用25 mmol/L葡萄糖处理前0.5 h先加入10 μmol/L LT处理〔9〕;高糖+LT+TG组采用25 mmol/L葡萄糖处理前0.5 h先加入10 μmol/L LT、0.2 nmol/L TG处理。

1.5CCK-8法检测细胞增殖 以5×103个细胞/孔的密度接种VSMCs并在96孔板中培养,分别孵育48 h以刺激细胞增殖。随后加入10 μl CCK-8试剂,将细胞在37 ℃下进一步孵育2 h,测量每组样品在450 nm波长处的光密度(OD)值评估细胞增殖。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 将各组细胞经胰蛋白酶消化后离心,洗涤细胞两次,然后重新悬浮在500 μl结合缓冲液中,在室温下于黑暗中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI溶液,染色15 min,通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.7划痕实验检测细胞迁移率 VSMCs(1.5×105/孔)接种在6孔板中,然后使用200 μl无菌移液器吸头进行刮擦,磷酸盐缓冲液(PBS)用于去除损伤的细胞,该时间点设置为0 h。各组VSMCs连续培养24 h。在0 h和24 h拍摄每个样品照片,用ImageJ测量0、24 h的划痕宽度评估VSMCs迁移率;迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.8Transwell实验检测细胞迁移 将预处理的各组细胞(1×105/孔)接种到无血清DMEM的上室中,下室补充有20%胎牛血清(FBS)的DMEM。孵育12 h后,迁移到下室的VSMCs用4%甲醛固定20 min,结晶紫染色。然后随机选取5个视野,在200倍光镜下对细胞进行计数。

1.9Western印迹检测IRE1-TRAF2-ASK1-JNK相关蛋白表达水平 收集所有细胞,用缓冲液于冰上裂解,然后测定总蛋白浓度,用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)从每个样品中分离10 μg总蛋白,之后转膜、封闭,将蛋白质转移到膜上并与IRE1、TRAF2、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK、β-actin一抗孵育过夜。然后使用二抗孵育并使其可视化,ImageJ软件分析蛋白表达水平。

1.10统计分析 采用SPSS26.0软件进行方差分析,两两比较行SNK-q检验。

2 结 果

2.1VSMCs鉴定 通过VSMCs特异性标志物-α-SMA染色进行鉴定,胞质内可见大量荧光,α-SMA抗体呈阳性,见图1。

图1 VSMCs鉴定(×200)

2.2LT对各组VSMCs增殖的影响 各组VSMCs增殖率比较:高糖组较空白组、高糖+TG组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+LT组均明显升高(P<0.05);高糖+LT组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+TG组均明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖、凋亡率、迁移率、迁移、IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路蛋白表达的影响

2.3LT对各组细胞凋亡的影响 各组细胞凋亡率比较:高糖+LT+TG组较高糖+LT组明显降低(P<0.05);高糖+LT组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+TG组均明显升高(P<0.05)。见表1、图2。

图2 各组细胞凋亡变化

2.4LT对各组细胞迁移率的影响 各组细胞迁移率比较:高糖组较空白组、高糖+TG组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+LT组均明显升高(P<0.05);高糖+LT组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+TG组均明显降低(P<0.05)。见表1、图3。

图3 划痕实验检测各组细胞迁移(×100)

2.5LT对各组细胞迁移数目的影响 各组细胞迁移数比较:高糖组较空白组、高糖+TG组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+LT组均明显增加(P<0.05);高糖+LT组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+TG组均明显减少(P<0.05)。见表1、图4。

图4 Transwell实验检测各组细胞迁移数(结晶紫染色,×200)

2.6LT对各组细胞IRE1-TRAF2-ASK1-JNK相关蛋白表达水平的影响 各组细胞中IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK比较:高糖组较空白组、高糖+TG组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+LT组均明显增加(P<0.05);高糖+LT组较高糖组、高糖+LT+TG组较高糖+TG组均明显减少(P<0.05)。见表1、图5。

1～6:空白组、高糖组、高糖+LT组、高糖+TG组、高糖+LT+TG组

3 讨 论

糖尿病性血管病尤其是动脉粥样硬化是糖尿病患者残疾、死亡的主要原因〔10〕。虽然糖尿病性血管病的发病机制仍不完全清楚,但大多危险因素集中在血管壁上,特别是VSMCs。VSMCs功能障碍可促进斑块体积的增长,加速细胞外基质的沉积,最终导致内瘘血管壁增厚、狭窄〔11〕,故靶向VSMCs可能是治疗糖尿病性血管病的新方向。

LT又称为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,价格低廉,且适用于维持性血液透析患者。在2型糖尿病肾病研究中,LT可以促进患者血管内皮功能恢复,治疗效果较佳,安全性较高〔12〕。随着糖尿病、高血压等此类代谢疾病发病率升高,心血管并发症逐渐增多,而血管内膜增生机制参与血管介入治疗后再狭窄、冠状动脉搭桥术以及动脉粥样硬化等心血管并发症的病理过程〔13,14〕。因此血管内膜增生机制是血管外科医生关注的问题。据报道血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可有效减少冠状动脉支架置入后继发的内膜增生〔15〕。应用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可通过调控血管平滑肌前体样细胞抑制动脉损伤患者内膜增生〔16〕。但是对于LT是否能通过抑制VSMCs增殖、迁移,促进其凋亡,改善VSMCs受损进而抑制血管内膜增生,达到治疗糖尿病性血管病目的尚不可知。本研究结果推测,LT在一定程度上可以抑制VSMCs过度增殖和氧化应激损伤,可作为糖尿病性血管病治疗的潜在药物,但其具体机制尚缺乏研究。

内质网应激是一种基本的细胞反应,会产生非折叠蛋白反应。研究发现内质网应激可导致VSMCs增殖,促进血管内膜增生、血管重构,减轻内质网应激可以抑制血管内膜增生〔17〕。IRE1属于内质网应激的效应蛋白,IRE1α是其中一种亚型,在各个细胞中广泛存在,一旦受到刺激,IRE1α便会解离进而募集TRAF2,之后共同激活ASK1,形成三聚体,促使JNK的磷酸化,参与细胞生命活动〔18〕。Xue等〔19〕研究发现,激活素A可通过抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路活化来保护PC12细胞免受内质网应激介导的凋亡和自噬性细胞死亡。Kim等〔20〕研究证明,LT可抑制内质网应激,抑制单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化,保护肾脏。本研究结果提示,IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的活化可能与高糖诱导的VSMCs损伤有关。LT可能通过抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路,降低内质网应激,抑制VSMCs受损。表明LT可抑制VSMCs增殖、迁移,促进细胞凋亡,与抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路有关。

综上,LT可能通过抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的激活,调节高糖诱导的VSMCs增殖、迁移和凋亡,可作为糖尿病性血管病治疗的潜在药物。