薯蓣皂苷对放射性肠黏膜炎症损伤小鼠的保护作用

孔凡国 彭涛 刁兴元 许昌芹

(1济南市人民医院消化内科,山东 济南 271100;2山东省立医院消化内科)

在2011年,癌症是经济发达国家的主要死因,也是发展中国家的第二大死因〔1〕。放疗是各种恶性肿瘤和严重疾病的重要治疗方式,尤其是鳞状细胞癌〔2〕。技术创新使局部辐射几乎可以传递到身体的任何部位〔3〕。但是,正常组织毒性仍然是临床放射治疗中最重要的剂量限制因素,且辐射对哺乳动物的生物学效应是剂量依赖性和累积性的〔4〕,这些不利的副作用,例如放射诱导的造血和胃肠道功能障碍甚至死亡,降低了患者的生活质量并限制了他们的放射治疗〔5〕。薯蓣皂苷是一种类固醇皂甙,是六味地黄汤和地心血康等中成药的有效成分〔6,7〕。《神农本草经》记载:“薯蓣香甜,平平,具有减少内脏损伤,增强供血不足的特点”,还可以祛邪除热,补气养血,促进肌肉生长。此外,薯蓣皂苷可以增加听觉和视觉的敏感性,并延长预期寿命〔8〕。近年来的一些研究表明,薯蓣皂苷可以通过调节多个靶点和信号通路来保护肝脏,肾脏,大脑和胃肠道损伤,并调节包括糖尿病,骨质疏松,肥胖和高尿酸血症在内的代谢疾病。此外,薯蓣皂苷对炎症和细胞凋亡具有有效的作用〔9,10〕。然而,薯蓣皂苷在放射诱导的肠黏膜损伤中发挥何作用尚不清楚。本研究旨在探究薯蓣皂苷对放射性肠黏膜炎症损伤的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 雄性BALB/c小鼠(7～8周龄)获自新乡医学院动物实验中心。将小鼠饲养在特定的无病原体,温度(23±1)℃,相对湿度(55±5)%,并进行12 h的明暗循环(从06∶00到18∶00点亮)的房间的笼子中,4只/笼。所有实验遵照新乡医学院第一附属医院动物护理和使用委员会批准。

1.2辐射暴露和实验方案 小鼠以1.2 Gy/min的吸收剂量率接受一次7.5 Gy的全身X射线照射(RS2000辐照器;Rad Source Technologies,Inc.,Suwanee,GA,美国),并不断循环新鲜空气避免在辐射室中产生缺氧状况。将小鼠保存在带孔的塑料瓶中以进行单独照射。

小鼠随机分为4组,每组10只,即正常对照(Con,不进行放射)组,X射线照射造模(RT)组,RT+150 mg/kg薯蓣皂苷和RT+300 mg/kg薯蓣皂苷组〔均进行腹部照射,且第0天均灌胃一次相应剂量薯蓣皂苷(Sigma Aldrich,USA,纯度≥93%)。Con组及RT组以相同方式灌胃生理盐水。通过直接心室穿刺获得血液样本,并在腹部照射后第3天收集小肠,实验独立进行了3次。并连续称量小鼠照射后16 d的体质量和食物摄入量。

1.3组织病理学 辐射后72 h,收集肠道组织,将组织固定在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中的4%多聚甲醛中,包埋在石蜡中,切成4 μm厚的切片,进行苏木素-伊红(HE)染色。使用Chiu等〔11〕定义的组织学损伤量表,以盲法评估和分级黏膜损伤,炎症和充血/出血。黏膜损伤根据以下标准从0～5分级:0级,正常黏膜绒毛;1级,绒毛顶端的上皮下出现格鲁恩哈根间隙,常伴有毛细血管充血;2级,上皮下间隙的扩张,并从固有层适度抬升上皮层;3级,大量的上皮向下举起绒毛的侧面,可能有一些裸露的尖端;4级,裸露的绒毛,带有固有层和扩张的毛细血管,可能是固有层的细胞增多;5级,固有层的消化和崩解,出血和溃疡。各个变化的得分总和构成辐射损伤得分(RIS)。

1.4TUNEL分析 辐射后72 h,收集肠道组织,使用TUNEL测定法评估凋亡程度。使用凋亡检测试剂盒(TdT-Fragel TM DNA片段检测试剂盒,QIA33,Calbiochem,美国)检测DNA片段化。下面列出的所有试剂来自试剂盒,并按照制造商的说明进行制备。将5 μm厚的肠段在二甲苯中脱蜡并通过梯度酒精进行水合;将它们与20 mg/ml蛋白酶K孵育20 min,并在TBST中冲洗;将切片与平衡缓冲液孵育10～30 min,用TBST冲洗;在37 ℃的湿润环境中将切片与TdT酶孵育90 min;随后在室温下放入预热的清洗缓冲液中10 min,并与封闭缓冲液一起孵育30 min。使用二氨基联苯胺(DAB)标记,甲基绿进行反染,将切片脱水并固定计数TUNEL阳性细胞,以TUNEL阳性细胞/100个肠绒毛细胞比例作为凋亡指数,盲法在10个随机选择的区域中使用NIS Elements BR3.1(日本尼康)软件分析TUNEL阳性信号。

1.5Western印迹 辐射72 h后,将小鼠处死,收集肠组织。从肠组织提取的蛋白质通过二喹啉甲酸(BCA)分析(Beyotime,中国)进行定量。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,将蛋白电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,经封闭后,室温分别孵育一抗抗Claudin-1(ab5694),抗ZO-1(ac5784)1.5 h,TBST洗膜3次后,室温孵育1∶2 000稀释的二抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记的免疫球蛋白(Ig)G,#7076,Cell Signaling Technology,美国〕45 min,TBST洗膜3次后,利用增强的电化学发光(ECL)试剂盒(#P0018AS,碧云天,上海)对目的条带显影,以β-actin(#AF0003,碧云天,上海)为内参,采用AlphaView软件测量目的条带的光密度。

1.6实时荧光定量-聚合酶链反应(qPCR)分析 根据制造商的说明,使用TRIzol试剂(美国,Invitrogen)从肠组织中分离总RNA。使用M-MLV逆转录酶产物(Promega,美国)。使用ABI 7500实时PCR系统(美国Applied Biosystems)进行qPCR。引物序列如下:IL-1β:上游引物:5′-GCAACTGTTCCTGAACTCA-3′,下游:5′-CTCGGAG CCTGTAGTGCAG-3′,TNF-α:上游引物:5′-GCCTCTTCTCATTCCTGCTT-3′,下游:5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3′,GAPDH:上游引物:5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′,下游:5′-GCTCCTGGAAGATGG-TGATGG-3′。qPCR变性条件下于94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,62 ℃ 40 s 40个循环。使用2-ΔΔCt比较法确定每个靶基因的相对表达,并针对GAPDH进行归一化。每个样品重复3次,并在3个独立的实验中重复。

1.7抗氧化状态的生化分析 将冷冻的肠组织匀浆。将匀浆物过滤并使用冷冻离心机在4 ℃下离心,将上清液等分装在-20 ℃下冷冻,直至用于生化分析。使用Lowry等〔12〕的方法测定上清液中的蛋白质含量。根据Draper等〔13〕的方法,测定了丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。

1.8统计学分析 采用GraphPad Prism6软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1薯蓣皂苷对放射性肠损伤临床症状的影响 与Con组比较,RT组辐射诱发的体质量和食物摄入量在辐射后2～16 d均显著下降(P<0.001);4～16 d与RT组比较,RT+150 mg/kg和300 mg/kg薯蓣皂苷组体质量和食物摄入量均显著上升,以RT+300 mg/kg薯蓣皂苷组最为显著(P<0.05)。见表1、表2。

表1 各组体质量变化比较

表2 各组食物摄入量变化比较

2.2薯蓣皂苷对放射性肠损伤的组织病理学和肠道细胞凋亡的影响 放射治疗组表现为肠道绒毛缩短,绒毛上皮缺失,多处糜烂,炎性细胞浸润,坏死和肠壁出血;然而经150和300 mg/kg薯蓣皂苷处理后,放射诱导的肠黏膜损伤明显改善。与Con组比较,RT组肠黏膜组织学评分明显增加,而薯蓣皂苷明显降低了放射诱导的肠黏膜组织学评分(P<0.01)。除此之外,还采用TUNEL分析方法检测了肠道细胞的凋亡程度,结果显示,与Con组比较,RT组肠道细胞凋亡率明显增加,而经150和300 mg/kg薯蓣皂苷处理后凋亡率明显降低,以300 mg/kg薯蓣皂苷处理组最为显著(P<0.01,P<0.001)。见图1、表3。

图1 薯蓣皂苷对放射性肠损伤的组织病理学和肠道细胞凋亡的影响(×40)

表3 薯蓣皂苷对放射性肠损伤的组织病理学和肠道细胞凋亡的影响

2.3薯蓣皂苷对放射诱导的肠组织中Claudin-1和ZO-1蛋白表达的影响 与Con组比较,RT组肠组织中Claudin-1和ZO-1蛋白表达均显著降低(P<0.001),而经150和300 mg/kg薯蓣皂苷处理后,放射诱导的肠组织中Claudin-1和ZO-1蛋白表达均显著升高(P<0.01,P<0.001),以300 mg/kg薯蓣皂苷处理组最为显著。见图2、表4。

1～4:Con组、RT组、RT+150 mg/kg薯蓣皂苷组、RT+300 mg/kg薯蓣皂苷组

表4 薯蓣皂苷对放射诱导的肠组织中Claudin-1和ZO-1蛋白表达、SOD、MDA水平和IL-1β、TNF-α mRNA水平的影响

2.4薯蓣皂苷对放射诱导的肠组织中SOD、MDA水平和IL-1β、TNF-α mRNA水平的影响 与Con组比较,RT组肠组织中SOD水平显著降低;而经150 mg/kg和300 mg/kg薯蓣皂苷处理后,放射诱导的肠组织中SOD明显升高,以RT+300 mg/kg薯蓣皂苷组最为显著(P<0.01,P<0.001);MDA水平变化与SOD相反。RT组肠组织中IL-1β、TNF-α mRNA水平较Con组明显升高,150 mg/kg和300 mg/kg薯蓣皂苷处理明显逆转了放射诱导的IL-1β、TNF-α mRNA水平升高(P<0.01,P<0.001)。见表4。

3 讨 论

放射疗法是治疗骨盆腔或腹部癌症患者的主要方法之一〔14,15〕。肠黏膜炎症损伤是放射疗法治疗腹部癌的最常见副作用,小肠对放射诱发的损害的敏感性是放射疗法处方剂量的限制因素。放射治疗引起的肠炎并伴有各种临床症状,降低了患者的生活质量,并增加了治疗费用和社会医疗费用〔16,17〕。目前尚没有广泛使用的方法来减少辐射诱发的肠炎的发生或减轻其严重性。本研究发现,在放疗时,给予薯蓣皂苷可显著减轻放疗引起的肠炎的临床症状,包括食物摄入减少和体质量减轻。这些作用可以通过减少细胞死亡,氧化应激和炎症来解释。

辐射消除癌细胞的机制涉及体内自由基的产生和癌细胞DNA结构的破坏,从而导致细胞死亡〔18〕。但是,在临床实践中,这种现象不仅发生在癌细胞中,而且在受放射线影响的正常组织中也发生。预防正常组织中的DNA损伤和随后的细胞死亡可以减少辐射的副作用。有研究〔16〕发现,射线照射会引起肠上皮屏障功能受损,因此在本研究中采用蛋白质免疫印迹方法分析了小肠中紧密连接分子Claudin-1和ZO-1蛋白水平,以评估了肠屏障功能,结果说明薯蓣皂苷能改善辐射诱导的肠上皮屏障受损。

辐射后发生的炎症可通过一系列过程诱导,包括ROS,DNA损伤,脂质过氧化和凋亡。尽管炎症对于解决体内各种类型的损伤是必需的,但是放射后发生的炎症会引起各种临床症状,持续的炎症可能会导致严重的后果,例如癌症。因此,尽早解决炎症通常是有益的。

综上,放疗时薯蓣皂苷治疗通过减少组织损伤,细胞死亡,氧化应激和炎症降低了辐射诱发的肠黏膜炎症损伤。因此,薯蓣皂苷对辐射引起的肠黏膜炎症损伤具有辐射防护作用。