健脾益气方干预内质网应激IRE1α-XBP1通路诱导腹膜间皮细胞自噬防治PF的机制

刘前程 刘鑫 邓湘雨 周成涵 钟文露 史伟,3 孟立锋,3

(1广西中医药大学,广西 南宁 530023;2广西中医药防治医学分子生物重点实验室;3广西中医药大学第一附属医院肾内科)

腹膜纤维化(PF)是腹膜透析(PD)患者最严重的并发症之一。腹膜间皮细胞(PMC)发生的上皮间充质转化(EMT)是PD过程中PF的早期事件,也是导致腹膜功能减退最终导致超滤衰竭的关键过程〔1〕。中药健脾益气方防治PD相关性PF在实验及临床研究中均已初步证实疗效〔2～4〕。机制研究方面,健脾益气方能够拮抗转化生长因子(TGF)-β/Smad信号通路、自噬及内质网应激(ERS)损伤〔5,6〕,已有研究表明健脾益气方能够抑制内质网应激IRE1α-XBP1通路〔5〕,然而,在体内外实验上尚缺乏ERS诱导自噬在PF疾病进展中的研究。本文拟探讨健脾益气方干预内质网应激IRE1α-XBP1通路诱导腹膜间皮细胞自噬防治PF的机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠72只,体质量150～180 g,由湖南斯莱克景达动物实验有限公司提供:SYXK(桂)2019-0001。动物实验伦理审批号:DW20210426-080。饲养于广西中医药大学第一附属医院动物实验中心,自由进食饮水。

1.2试剂 4.25% PD液(PDS,广州百特医疗,批号:6AB9896);热休克蛋白家族成员葡萄糖调节蛋白(GRP)78、pIRE1α、XBP1s、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ、自噬相关蛋白Beclin-1、E-钙黏蛋白(cadherin)、α-肌动蛋白(SMA)测定试剂盒(英国Abcam公司)。

1.3药物 健脾益气方颗粒:黄芪30 g、党参15 g、白术10 g、茯苓15 g、丹参15 g、大腹皮6 g、川芎7 g、葛根15 g、炙甘草8 g,由江阴天江药业有限公司生产,广西中医药大学第一附属医院药剂科提供。按大鼠体表面积计算方法得出36、18、9 g/(kg·d)作为中药高、中、低组。牛磺熊去氧胆酸片(格利普生物科技有限公司,规格:200 mg),大鼠剂量为1.8 mg/(kg·d)。

1.4分组与给药 72只大鼠,随机数字法分为假手术组、模型组、西药组、中药高、中、低剂量组,每组12只。模型组与假手术组予生理盐水2 ml,晨间灌胃,1次/d,连续4 w。

1.5PF模型的制备 假手术组不切除肾脏,只剥离肾脏包膜。模型组、西药组、中药高、中、低剂量组采取5/6肾切除联合腹腔注射4.25%PD液(PDS)的方法构建PF大鼠模型,具体方法参照文献〔2〕。

1.6取材 第28天灌胃后处死大鼠,取壁层腹膜组织。修剪成约5 mm×5 mm大小。一半浸入多聚甲醛液(PLP)液中,4 ℃冰箱固定8 h,常规石蜡包埋。另一半,置-70 ℃冰箱保存待测。

1.7大鼠一般情况 检测精神状况、饮食、活动及体质量等。

1.8苏木素-伊红(HE)染色观察腹膜组织形态学改变 取大鼠腹膜组织,常规固定、脱水、石蜡包埋、切片后,行HE、铀-铅双染色,光镜下观察腹膜形态学变化。

1.9RT-聚合酶链反应(PCR)法测定IRE1α-XBP1通路自噬及纤维化标志表达变化 Trizol一步法提取总RNA;紫外分光光度计测A值,波长260/280 nm比值介于1.8～2.0。DNA的合成参照Invitrogen反转录试剂盒操作程序进行。引物设计采用olige6和Primer5.0软件联合设计,引物序列(5′-3′):GRP78上游:CGTCGTATGTGGCCTTCACT,下游:ATTCCAAGTGCGTCCGATGA;XBP1s上游:CCGCAGCACTCAGACTACG,下游:GCAACAGCGTCAGA ATCCAT;E-cadherin上游:AGCTCGCTGAACTCCTCTGA,下游:TCGCCGCCACCATACATATC;a-SMA上游:AGAACACGGCATCATCACCA,下游:TCCGTTAGCAAGGTCGGATG;LC3-Ⅱ上游:GCCTTCTCTAAAAGGGCTTCTACT,下游:TGGAGACCTCTGCTAGGCAA;Beclin-1上游:GCCTCTGAAACTGGACACG A,下游:GCCTGGGCTGTGGTAAGTAA;βactin上游:CGTAAAGACCTCTATGCCAACA,下游:TAGGAGCCAGGGCAGTAATC。

1.10Western印迹测定GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA及E-cadherin表达变化 400 μl裂解液提取腹膜组织总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测量蛋白浓度后,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)垂直电泳,转膜。脱脂奶粉封闭后,分别加入抗体,孵育过夜。Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)洗涤后,室温下孵育二抗30 min,电化学发光(ECL)液显色。

1.11免疫组化检测GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA及E-cadherin表达变化 采用SP法,一抗(GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin) 稀释到合适浓度(1∶200),严格按照免疫组化步骤进行操作。应用LeicaQwin550图像分析软件进行半定量分析,每组随机选取8张切片,400倍视野下测定阳性面积比。

1.12统计学方法 采用SPSS22.0软件处理。数据呈正态分布且总体方差齐,两组间均数比较用t检验,多组间均数比较用单因素方差分析;数据不呈正态分布用秩和检验,用中位数和四分位数间距来进行统计描述。

2 结 果

2.1各组一般情况 实验期间,先后有14只实验大鼠死亡,死亡原因包括麻醉过量、灌胃不当等。最终大鼠数量为:假手术组11只,模型组、西药组、中药低剂量组各10只,中药高剂量组9只,中药中剂量组8只。各组试验期间具有明显差异,假手术组饮食良好,体质量正常增加,且毛发光泽、反应灵敏、活动自如;模型组进食减少,体质量增长缓慢,毛发稀疏、反应迟缓、活动减少;与模型组相比,经干预后,西药、中药高、中、低剂量组以上情况均有一定程度改善。

2.2光镜下各组腹膜病理 如图1所示,假手术组腹膜组织表面为一层扁平连续的PMC;模型、西药、中药高、中、低剂量组腹膜组织PMC均有不同程度的脱落,间皮下基质有不同程度的增生及形态学上的改变,PMC呈现为圆形或柱形,以模型组表现最为明显,提示本次实验PF模型构建成功。其次,与模型组比较,西药、中药高、中、低剂量组上述症状有所改善,其中中药高剂量组改善情况最明显。

图1 各组腹膜组织(HE染色,×400)

2.3免疫组化测定结果 如表1所示,与假手术组比较,模型组GRP78、pIRE1α、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA水平明显上调,E-cadherin水平明显下调(P<0.05),表明高糖PDS诱导了大鼠PF,并且激活了PMC ERS及自噬。与模型组比较,西药及中药各剂量组GRP78、pIRE1α、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA表达明显下调,E-cadherin表达明显上调(P<0.05),表明健脾益气方能够抑制ERS及自噬水平,改善纤维化,且程度与药物浓度相关。

表1 各组腹膜组织GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、E-cadherin、α-SMA蛋白阳性面积比较

2.4各组RT-PCR法及Western印迹法测定结果 与假手术组比较,模型组GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白和mRNA及pIRE1α蛋白水平显著上调,E-cadherin蛋白和mRNA明显下调(P<0.05),表明PD大鼠ERS及自噬激活,PF发生。与模型组比较,西药组及中药高、中、低剂量组GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白和mRNA水平及pIRE1α蛋白水平显著下调,E-cadherin蛋白和mRNA水平明显上调(P<0.05);表明健脾益气方能够抑制ERS、自噬的激活,改善PF。见表2、表3、图2。

表2 各组腹膜组织 GRP78、XBP1s、pIRE1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、E-cadherin、α-SMA 蛋白表达量比较

表3 各组腹膜组织GRP78、XBP1s、LC3-Ⅱ、Beclin-1、E-cadherin、α-SMA mRNA表达量比较

1～6:假手术组、模型组、西药组、中药高、中、低剂量组

3 讨 论

PF并没有中医专属病名,现代医家针对其病机及临床表现,将其归属于“水肿、虚劳、关格”等范畴论治,但并不能概括PD相关性PF疾病全貌。在病机认识上,姜晨等〔7〕认为,PD患者以气血、阴阳亏虚为其病机关键,而瘀血、顽痰阻络是疾病进一步加重的重要因素。曹曼等〔8〕认为,脾虚挟湿浊、血瘀是导致PD患者PF的关键病机。杨波等〔9〕认为肾衰竭患者行PD治疗后病机关键没有改变,所以,PD相关超滤衰竭的主要病机仍为脾肾亏虚、湿浊瘀血内蕴。课题组认为,开始PD后,邪有出路,标实减轻,虚证成为PD患者病机关键,并且肾脏功能被腹膜透析所替代,从而提出以微观辩证为依据的“脾气亏虚”基本病机〔10〕,组方健脾益气方具有“健脾益气、理气活血和络”的功效,契合PF的中医病机,临床疗效显著〔2,11〕。本研究结果表明,健脾益气方对PD大鼠腹膜具有保护作用。

已知病理生理损伤会导致未折叠蛋白在内质网中积累并引起ERS,并通过未折叠蛋白反应(UPR)恢复内质网稳态,促进细胞存活。内质网既可以接收信号,GRP78被视为ERS发生和UPR激活的标志〔12,13〕。既往一些研究集中在ERS在纤维增生性疾病中的作用。如在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的发生发展中,ERS促进了细胞凋亡的发生〔14〕;抑制肺、心脏ERS能够减轻结晶二氧化硅诱导的肺纤维化、改善大鼠心肌坏死的情况〔15,16〕。研究表明,PD可使腹膜间皮细胞产生ERS,ERS可以通过IRE1α-XBP1通路直接诱导激活自噬,重建内质网稳态〔17,18〕。在高糖刺激的人PMC中,XBP1s表达增加,并且与PMC的EMT这一现象呈显著正相关,表明XBP1s是PD相关性PF重要的分子之一〔19〕。本研究与既往研究一致。前期研究曾发现健脾益气方抑制IRE1α、XBP1、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达,从而减轻腹膜间皮细胞EMT〔5〕。提示健脾益气方可能通过抑制IRE1α-XBP1通路,对PD大鼠腹膜起到保护作用。

多种细胞程序进程都有自噬的参与,在某些情况下,自噬促进细胞的存活,异常的自噬(自噬过多或受损)会导致细胞死亡〔20,21〕。尽管有报道指出高糖会诱导激活自噬,但导致自噬激活的上游信号传导仍不清楚〔22,23〕。研究表明,ERS是自噬的有效触发因素〔24,25〕,但是在自噬水平增高对ERS状态下PMC的命运有何影响,目前尚存在争议。例如,在肾小管纤维化中,ERS可能通过PERK-eIF2α途径诱导自噬的激活,促进纤维化和细胞凋亡〔26〕;在胰腺纤维化中,Ren等〔27〕亦证实,ERS导致自噬的激活,通过抑制ERS诱导的分子伴侣介导的自噬可以减轻胰腺纤维化。与以上ERS状态下自噬水平增高促进纤维化、细胞凋亡的结论相反的是,部分学者认为自噬是细胞对抗损伤的一种重要的代偿保护机制。例如,在肾脏上皮细胞中,ERS通过诱导激活自噬减轻足细胞的损伤,起到防止细胞死亡的保护作用〔28,29〕;在神经元细胞中,Zhou等〔30〕发现,七氟烷可诱导神经元细胞ERS并激活自噬,从而拮抗了细胞凋亡。然而,在体内、体外实验上尚缺乏ERS诱导自噬在PF疾病进展中的研究。本文前期研究〔31〕发现,高糖PDS诱导PD大鼠PMC自噬激活,促进α-SMA并下调E-cadherin表达。

PMC的EMT是PF的起始环节和可逆阶段,在PF的发病进程中起着关键作用。本研究提示健脾益气方能拮抗PD大鼠EMT的进展。IRE1α-XBP1信号通路是一个重要的调节枢纽,它把ERS、自噬和EMT联系了起来。本研究结果表明健脾益气方能够通过干预ERS通路IRE1α-XBP1诱导PMC自噬,激活其适应性保护作用,逆转高糖PDS刺激下的PMC损伤,达到减轻腹膜间皮细胞EMT,保护PMC存活、改善腹膜功能,拮抗PF作用,为PD诱导PF的发病机制研究及中医药治疗提供新的思路和方法,其临床应用疗效仍需要研究。