桑白皮多糖介导Nrf2/ARE通路减轻慢性低氧环境大鼠心肌损伤的作用

王晓磊 黄辉 陈昕芳 李红

(昆山市中医医院肺病科,江苏 昆山 215300)

心肌低氧是人体功能紊乱的常见问题之一,临床上如心肌梗死、心绞痛及高原环境下均长期处于慢性低氧状态,而长期处于低氧环境会加重心肌损伤,严重损害心功能〔1〕。目前临床上对于低氧引起心脏疾病的治疗主要为氧疗和激素治疗,虽具有一定缓解作用,但仍对多个组织器官造成不可逆转的损害〔2〕,因而探索高效的药物对于预防和减轻低氧造成的心肌损伤具有重要意义。桑白皮多糖提取自桑白皮,已有研究报道桑白皮多糖对心肌细胞损伤具有保护作用,推测与抗氧化应激有关〔3〕。心肌细胞的氧化应激反应在低氧诱发的心肌损伤过程中发挥重要作用〔4〕。转录因子NF-E2相关因子(Nrf)2/抗氧化反应元件(ARE)是参与氧化应激反应的关键,在心血管系统广泛分布,研究发现通过调控Nrf2/ARE通路,可调控心肌组织的氧化应激反应,发挥对低氧诱发心肌损伤的保护作用〔5〕。然而桑白皮多糖能否通过介导Nrf2/ARE通路调控慢性低氧环境诱导的心肌损伤尚未可知。鉴于此,本研究选取SD大鼠进行动物学实验,研究桑白皮多糖通过介导Nrf2/ARE通路调控慢性低氧环境中心肌损伤的作用与机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 60只成年SD大鼠(30只雄性、30只雌性),7～9周龄,清洁级,体质量200～250 g,武汉大学动物实验中心〔SCXK(鄂)2019-0004〕。

1.2实验药品与试剂 苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝,批号G1120-3);桑白皮多糖(上海益本,批号sbp);阿托伐他汀(江西瑞威尔,批号134523-00-5);血浆肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(上海名劲,批号B7322、B6475、B5503);大鼠丙二醛(MDA)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海沪震,批号hz-E12532);原位末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(碧云天,批号C1098);总核糖核酸(RNA)提取试剂盒〔天根生化科技,批号DP431〕;Nrf2、血红素加氧酶(HO)-1、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(上海雅吉合成);总蛋白提取试剂盒(上海雅吉,批号YD-001);细胞核蛋白提取试剂盒(上海梵态,批号FT30504yy);二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(南京诺唯赞,批号E112-01);兔抗大鼠Nrf2、p-Nrf2、H3、HO-1、Bcl-2、Bax、GAPDH单克隆抗体,羊抗兔Nrf2、p-Nrf2、H3、HO-1、Bcl-2、Bax、GAPDH辣根过氧化物酶标记多克隆抗体(武汉益普,批号ab137550、A0674、9715、82206、ab73985、2772、2118;32460、A27036、G-21234、31466、A24531、31462、A16116)。

1.3实验仪器 Gas Blender型常压低氧舱(上海玉研科学仪器有限公司);BX46型光学显微镜(日本奥林巴斯);7500型聚合酶链反应(PCR)仪(美国ABI)。

1.4建模、分组及干预 采用随机数字表分6组,各10只。除对照组外构建慢性低氧环境中的心肌损伤模型大鼠〔6〕:腹腔注射4 ml/kg生理盐水,常压低氧舱氧浓度为(10±1)%,每天10 h,每周6 d;对照组呼吸室内空气。模型构建结束后24 h,HE染色,常规固定切片→脱蜡→苏木素染色→盐酸乙醇分色→伊红复染→脱水→封片→观察。心肌组织广泛存在变性坏死病灶,心肌纤维排列紊乱表明建模成功〔7〕。自低氧第1天起,阿托伐他汀组给予20 mg/kg阿托伐他汀腹腔注射给药,桑白皮多糖低、中、高剂量组分别给予0.1、0.2、0.4 μg/ml桑白皮多糖腹腔注射给药,对照组和模型组仅予腹腔注射生理盐水。

1.5HE染色观察各组心肌组织病变情况 末次给药后24 h,处死后HE染色观察各组心肌组织病变情况,步骤同上。

1.6TUNEL检测各组心肌细胞凋亡率 末次给药后24 h,处死进行TUNEL检测心肌细胞凋亡率。细胞核出现棕黄色或棕褐色为阳性,测定凋亡率。

1.7血清氧化应激指标检测 末次给药后24 h,取腹主动脉血5 ml以酶联免疫法测定。血样静置4 h,3 000 r/min、15 min离心,取上清即为血清;取各组心肌组织100 mg,匀浆机研磨后3 000 r/min、30 min离心。取上清测定血清CK、LDH和心肌组织SOD活性及MDA水平。

1.8心肌组织Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax基因表达 末次给药后24 h处死,以实时-逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测。提取总RNA后逆转录,充分混匀各体系,然后95 ℃ 5 min→30个循环(95 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s)→72 ℃ 10 min〔8〕,计算2-ΔΔCt。引物序列:Nrf2上游引物5′-CTTTTGGCGCAGACATTCCC-3′,下游5′-GACTGGGCTCTCGATGTGAC-3′;HO-1上游引物5′-CAGTGCCACCAAGTTCAAGC-3′,下游5′-GTTGAGCAGGAACGCAGTCTT-3′;Bcl-2上游引物5′-GGACAACATCGCCCTGTG-3′,下游5′-AGTCTTCAGACAGACAGCCAGGA-3′;Bax上游引物5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′,下游5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′;GAPDH上游引物5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3′,下游5′-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3′。

1.9Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表达及p-Nrf2水平 末次给药后24 h,处死取心肌组织,裂解、提取总蛋白、蛋白定量、上样、电泳、转膜、封闭。一次加入一抗、二抗,前者4 ℃过夜、后者室温2 h。显色、扫描并分析蛋白条带灰度值,计算相对表达量。

1.10统计学分析 采用SPSS23.0软件进行One way ANOVA分析与SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA和蛋白及p-Nrf2水平比较 与对照组比较,模型组Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白和mRNA表达明显下降,Bax蛋白和mRNA表达、p-Nrf2、p-Nrf2/Nrf2水平明显上升(P<0.05);与模型组比较,阿托伐他汀组与桑白皮多糖各剂量组Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白和mRNA表达及p-Nrf2、p-Nrf2/Nrf2水平明显上升,Bax蛋白和mRNA表达明显下降(P<0.05)。见图1、表1和表2。

1～6:对照组、模型组、阿托伐他汀组、桑白皮多糖低、中、高剂量组

表1 各组Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表达比较

表2 各组Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表达及p-Nrf2、p-Nrf2/Nrf2水平比较

2.2心肌组织病理观察 对照组心肌组织正常;模型组心肌严重损伤,可见广泛坏死,心肌纤维排列紊乱,纵横纹不清;阿托伐他汀组和桑白皮多糖低剂量组心肌组织坏死病灶减少,心肌纤维排列紊乱;桑白皮多糖中剂量组心肌组织坏死病灶进一步减少,心肌纤维排列更加整齐;桑白皮多糖高剂量组心肌组织趋于正常。见图2。

图2 各组心肌组织(HE染色,×400)及心肌细胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.3各组心肌细胞凋亡率比较 与对照组比较,模型组心肌细胞凋亡率明显上升(P<0.05);与模型组比较,阿托伐他汀组和桑白皮多糖各剂量组心肌细胞凋亡率明显下降(P<0.05);桑白皮多糖各剂量组心肌细胞凋亡率呈剂量依赖性。见图2、表3。

表3 各组心肌细胞凋亡率、CK、LDH、心肌组织SOD活性及MDA水平比较

2.4各组CK、LDH、心肌组织SOD活性及MDA水平比较 与对照组比较,模型组CK、LDH活性和MDA水平明显上升,SOD水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,阿托伐他汀组和桑白皮多糖各剂量组CK、LDH活性和MDA水平明显下降,SOD水平明显上升(P<0.05);桑白皮多糖各剂量组CK、LDH活性和MDA水平呈剂量依赖性降低,SOD水平呈剂量依赖性上升。见表3。

3 讨 论

心肌细胞凋亡和氧化应激损伤是低氧环境中心肌损伤发生发展过程中重要的病理机制〔9〕。长期处于低氧状态所导致的心肌损伤严重影响心脏功能,同时还导致和诱发诸多其他脏器的病理损伤及衰竭〔10〕,因此寻找高效的药物至关重要。

本研究结果显示,模型组心肌细胞损伤明显,心肌组织结构不清,固缩,血浆溶解,与既往研究〔11〕构建模型结果一致,表明本研究成功构建慢性低氧性心肌损伤模型。阿托伐他汀可有效抑制心肌组织氧化应激反应,减少心肌细胞凋亡〔12〕,故选取其为阳性对照,符合实验原则。本研究中,桑白皮多糖可改善心肌组织损伤的病理情况,抑制心肌细胞凋亡。低氧引起的心肌损伤常伴随氧化应激反应〔13〕,研究指出,桑白皮多糖具有抗氧化功能〔14〕,据此推测桑白皮多糖可能通过抗氧化功能发挥对心肌组织的保护作用。

Nrf2/ARE通路作为抗氧化应激的核心通路之一,与心肌损伤的调节密切相关〔15〕;正常生理条件下,Nrf2锚定于胞质中,只有极少部分活化的Nrf2入核与ARE识别并结合,使抗氧化物处于基础表达水平,维持细胞的稳定状态,当受到外界如缺氧刺激时,Nrf2迅速被磷酸化激活入核,识别并结合ARE序列,启动下游细胞内氧化-还原平衡蛋白基因的表达,从而增强细胞对于氧化应激的耐受性〔16〕。Dang等〔17〕指出,通过增强Nrf2/ARE通路可减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化损伤。HO-1是Nrf2/ARE通路下游重要的靶基因,在细胞内源性抗氧化过程发挥重要作用〔18〕。当心肌缺氧损伤时会导致心肌酶LDH和CK释放入血,清除自由基的首要物质SOD活性降低,脂质过氧化产物MDA含量增加〔19〕。Bcl-2发挥抑制细胞凋亡的功能,Bax发挥促进细胞凋亡的功能,两者在心肌细胞损伤中至关重要〔20〕。刘琳〔21〕指出,通过激活Nrf2/ARE通路,促进Nrf2、HO-1、Bcl-2表达,抑制MDA、Bax表达,抑制心肌细胞氧化应激水平和凋亡,保护心肌细胞免受缺氧-复氧损伤;崔玉祥等〔22〕指出,通过激活Nrf2/ARE通路,上调p-Nrf2/Nrf2水平,下调心肌酶活性和MDA水平,上调SOD活性,可保护心肌细胞免受缺氧复氧损伤。本研究与上述分析相符,提示桑白皮多糖很可能通过激活Nrf2/ARE通路减轻慢性低氧环境心肌损伤。

综上,桑白皮多糖可减轻慢性低氧环境大鼠心肌损伤,可能通过激活Nrf2/ARE通路,促进HO-1、Bcl-2表达,增加SOD活性,下调CK和LDH活性和MDA水平,抑制Bax表达保护心肌组织。另外,桑白皮多糖呈剂量依赖性,在一定剂量范围内可增加该药物使用剂量以发挥增效目的。