基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响

黄贺明 于贺美 韩晴

(衡水市中医医院,河北 衡水 053000)

慢性肾衰竭(CRF)主要是因为代谢产物与毒物在肾组织中积累,使机体内水、电解质及酸碱平衡被打破,生理功能发生异常,直接或间接引起肾脏损害,其特征为肾功能缓慢下降,从而导致不可逆肾硬化和肾单位丢失〔1〕。胃肠道是肾脏疾病“被遗忘的器官”,有研究结果慢性肾功能不全可导致肠道菌群改变和肠屏障功能受损,而肠道微生态失调又可以诱导其进展及发生并发症〔2〕。研究提出〔3〕慢性肾功能不全“肠-肾轴”概念,着重强调肠道微生态失调在慢性肾功能不全患者炎症状态中所扮演的重要作用。中医学认为,CRF患者表现出的胃纳下降、恶心、呕吐等消化道症状及常见的一些肠道器质性病变的发生是与脾胃功能失调密切相关,且脾胃功能失调贯穿于CRF病变的始终。有研究表明〔4〕,CRF与肠道微生态紊乱及肠黏膜屏障功能的损伤相互影响,CRF患者会使体内尿酸积累于体液中,使得大部分废弃物从肠道释放,在肠道中以废弃物为营养物质的菌群增加,使得肠道菌群失衡。大黄、黄芪为治疗CRF的常用药材。大黄、黄芪归大肠经,用于CRF可能是通过肠-肾轴实现。本研究运用自拟芪黄苁蓉通便散治疗CRF大鼠,该方的主要组成包括黄芪、大黄及肉苁蓉等,具有健脾益肾、祛瘀降浊的功效。此外,在CRF产生及发展过程中还有多种信号通路参与其中。细胞外信号调节激酶(ERK)1/2-糖原合成酶激酶(GSK)3β-核因子(NF)κB信号通路中,ERK1/2是细胞内信号转导的重要通路,参与炎症和纤维化等的过程;GSK3β磷酸化后可调控代谢等多种蛋白表达,还可转录激NFκB等因子水平,促进炎症反应。研究证实〔5〕,磷酸化的GSK3β可调控NFκB及下游靶分子,参与免疫反应和炎症调节反应。但该通路在CRF中的具体作用尚未有相关文献报道。本研究基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物 40只SD大鼠购自长沙市海天勤公司提供〔许可证号:SCXK(湘)-2020-0120〕,体质量200～300 g,自由饮食饮水,适应性喂养1 w后进行实验。本实验已通过医院医学伦理委员会审批。

1.2实验试剂 芪黄苁蓉通便散外用穴位贴敷、复元四红散中药材(安国市御颜坊中药材有限公司),肾功能及氧化应激相关指标试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司),苏木素-伊红(HE)染色液(南京生航生物技术有限公司),ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白一抗(北京百奥思科生物医学技术有限公司),辣根过氧化物酶二抗(上海李记生物科技有限公司)。

1.3实验药物 芪黄苁蓉通便散外用穴位贴敷:生黄芪、大黄、大黄炭各30 g,酒苁蓉20 g,厚朴15 g,冰片6 g。诸药研为细末,过200目细筛,充分混匀,以蜂蜜80 g调为膏状。复元四红散:丹参 50 g,生大黄、红花 、红藤 、赤芍、川芎、川乌各30 g,乳香、没药各15 g,生甘草 10 g。

1.4模型建立及干预 在40只中随机抽取10只作为健康组进行对照,剩余30只采用经典5/6肾切除术制造模型,将30只大鼠运用4%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位固定鼠台上,备皮,消毒,从左肋骨下缘,脊柱旁开1.5 cm处纵向切口,长约1.5 cm,暴露左侧肾脏,减掉左肾上、下极2/3肾实质。1 w后切去右肾,手术过程同上。以血肌酐(Scr)高于正常值,肾脏组织有炎性细胞浸润、肾间质纤维化等为建模成功〔6〕。大鼠全部建模成功,将模型大鼠随机分为模型组、治疗组、药物对照组。健康组与模型组常规饲养;治疗组用75%乙醇棉签清洁贴敷穴位,将芪黄苁蓉通便药糊每1 g外敷在神阙穴、双侧天枢穴、大肠俞上,外用防过敏且透气的贴敷固定,6～8 h后取下,1次/d,共治疗28 d。药物对照组每次取0.5～1.0 g复元四红散,置于纱布上,敷在大鼠双肾俞,固定后12 h取下,1次/d,共治疗28 d。

样品采集:给药结束12 h后,麻醉各组大鼠,腹主动脉取血,3 000 r/min 离心15 min(离心半径13 cm)取上清,-20 ℃保存备用。同时收集各组肾脏组织,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后,部分置于4%多聚甲醛固定,部分保存于-80 ℃超低温冰箱,用于后续实验。称取0.1 g标本制成匀浆,进行细菌培养。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾功能、氧化应激相关指标水平 取各组血液样本,以3 000 r/min离心10 min,离心半径为12 cm,将上清冻存于-20 ℃冰箱,ELISA检测肾功能指标尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、血肌酐(Scr)水平,氧化应激指标脂质氧化丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平,实验严格按照试剂盒说明书进行。

1.6肾组织形态学 将各组大鼠麻醉后,取肾组织,手术刀剪成小块,漂洗后用4%多聚甲醛固定24 h,流水冲洗1 h用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液脱钙2个月,脱水,浸蜡,包埋制成石蜡块,常规切片,行HE、Masson染色后,中性树胶封固,显微镜下观察肾组织病理形态。

1.7检测大鼠肠道菌群 釆集粪便检测大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌计数并鉴定。选取典型菌落数15～150 CFU、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位表示。鉴定方法采用革兰染色法。

1.8Western印迹检测ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白 取各组肾组织,剪碎,匀浆,离心后取上清,测定蛋白浓度。将组织裂解产物进行电泳,硝酸纤维素膜转印,5%脱脂奶粉封闭2 h,加入ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、细胞间黏附分子(ICAM)-1一抗(1∶500)孵育4 h,加入辣根过氧化物酶二抗(1∶1 200)孵育4 h,杂交冲洗。后将膜浸入ECL工作液,后进行检测并获取图像。化学发光试剂盒检测蛋白含量。本研究另选取10只大鼠建立肾衰竭模型后每周给予大鼠尾部注射ERK1/2-GSK3β-NFκB通路抑制剂TDZD-8 1 mg/kg,共28 d,分为抑制剂组,进一步为芪黄苁蓉通便散贴敷治疗肾衰竭提供依据。

1.9统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组BUN、Scr、UA水平比较 模型组BUN、Scr、UA水平显著高于健康组(P<0.05);治疗组与药物对照组显著低于模型组(P<0.05);且药物对照组显著高于治疗组(P<0.05),见表1。

表1 各组BUN、Scr、UA水平比较

2.2各组SOD、CAT、MDA水平比较 模型组较健康组SOD、CAT水平显著降低,MDA水平显著升高(P<0.05);治疗组与药物对照组较模型组SOD、CAT水平显著升高,MDA水平显著降低(P<0.05);与治疗组相比,药物对照组SOD、CAT水平显著降低,MDA水平显著升高(P<0.05),见表2。

表2 各组SOD、MDA、CAT水平及肠道菌群菌落总数比较

2.3芪黄苁蓉通便散贴敷对各组肾组织形态学的影响 HE染色:健康组肾组织结构正常;模型组肾小球变形,肾小管扩张,大量炎性细胞浸润;与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善。Masson染色:健康组结构正常;模型组出现肾组织肾小管发生变性、萎缩、破坏及再生等病理改变,间质中单核与淋巴细胞浸润及胶原纤维表达最多;治疗组与药物对照组肾小管、间质的病理改变得到有效改善,蓝色胶原纤维沉积也呈下降趋势,见图1。

图1 各组肾组织形态学(×200)

2.4芪黄苁蓉通便散贴敷对肠道菌群的影响 模型组较健康组肠球菌、肠杆菌双歧杆菌显著增加,乳酸杆菌显著减少(P<0.05);与模型组相比,治疗组与药物对照组肠球菌、肠杆菌显著减少,双歧杆菌、乳酸杆菌显著增加(P<0.05);与治疗组相比,药物对照组肠球菌、肠杆菌显著增加,双歧杆菌、乳酸杆菌显著减少(P<0.05),见表2。

2.5芪黄苁蓉通便散贴敷对ERK1/2-GSK3β-NFκB通路蛋白表达的影响 与健康组相比,模型组ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、MCP-1、ICAM-1水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,治疗组、药物对照组与抑制剂组以上指标均显著降低(P<0.05),治疗组与抑制剂组以上指标差异无统计学意义(P>0.05);与抑制剂组比较,药物对照组以上指标均显著升高(P<0.05)。见表3、图2。

图2 各组ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白表达

表3 各组ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白表达

3 讨 论

多项实验证实抑制GSK3β可抑制炎症反应,对机体起到保护作用〔7,8〕。研究表明〔9〕,GSK3β支持NFκB的转录活性,NFκB介导MCP-1、ICAM-1炎症因子的表达需要GSK3β的高效表达。相关因子磷酸化ERK1/2后,促使胞外的信号转移至胞内,发挥调控细胞生物学行为的作用。研究表明〔10〕,ERK1/2的持续活化是T细胞增殖、T1细胞分化及肾脏细胞纤维表型转化的重要信号通路。研究表明〔11〕磷酸化ERK1/2上调可磷酸化下游GSK3β分子,调控心肌细胞线粒体通透性转换孔的闭合,阻断ERK1/2-GSK3β可保护心肌免受再灌注损伤。当肾功能减退时,肌肉代谢产物 Scr、血浆含氮化合物 BUN 和嘌呤代谢终产物UA会累积于血液而作为肾功能损伤的重要指标。周琴〔12〕研究提示,通过抑制磷酸化ERK1/2水平,抑制GSK3β磷酸化水平,进而抑制NFκB的转录活性,从而抑制其下游炎症因子MCP-1、ICAM-1水平,发挥抑制肾纤维化及降低炎症水平、保护肾功能的作用。赵凯亮等〔13〕研究表明,通过抑制GSK3β水平,降低GSK3β磷酸化的表达,进而抑制NFκB水平,降低BUN、Scr活性,改善肾功能。这提示抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路具有改善肾功能的作用。在中医学将CRF归属于“水肿”“癃闭”等范畴,多为其他慢性疾病或并发症发展而来。其病因病机为脾肾亏虚,湿浊蕴结,病脏为脾肾,并与肠相关。“久病多瘀”,近年医家认为,CRF的进展里“瘀”伴随肾虚贯穿于肾脏疾病的始终,随其产生而又加重其进程。方中生黄芪性味甘,微温,归肺,脾经。用生黄芪以健脾补中,益卫固表。生大黄性寒,善于泻火解毒、逐瘀通经。大黄泻下作用峻猛,脾胃虚弱者慎用,但将大黄炭化不仅可降低其苦寒之性,减少对脾胃的损伤,而且可增强大黄的活血化瘀疗效,促进降浊排毒功能的发挥。故大黄、大黄炭合用,祛邪而不伤正。肉苁蓉味甘,咸,性温,归肾、大肠经,具补肾助阳等功效,久治后能活血通络效果更佳。厚朴性温,味苦、辛,下气除满和燥湿是其主要功效。其主入脾胃经,为调节脾胃升降,通降胃气之要药。冰片可协助药物透过人体屏障,使多种药物更好地通过皮肤吸收,具有长效且稳定的优点,作为佐药帮助其他药物更好地发挥疗效。以上几种药物具有健脾益肾、祛瘀降浊之效,用蜂蜜调和可增加药物温中健脾的作用,避免药物对脾胃的损伤。诸药穴位贴敷外用很容易通过浅表皮肤渗入皮下,此方法避免了肝脏的首过效应和消化酶对药物成分的分解破坏,使药物最大程度发挥其主要功效。研究提示〔14～16〕,大黄、黄芪、肉苁蓉可改善肾功能。此外研究证实〔17〕,复元四红散对CRF具有一定的治疗效果,本研究与上述研究结果相似,提示芪黄苁蓉通便散贴可改善CRF大鼠肾功能。此外,Western印迹结果显示,芪黄苁蓉通便散贴可抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB相关蛋白的表达,且其抑制水平与抑制剂组接近。因此,本研究认为芪黄苁蓉通便散贴可能是通过抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路的激活,从而发挥肾功能的保护作用。

CRF严重危害人类的健康,可引起各大器官疾病甚至衰竭,其发生机制可能与炎症状态下肠道菌群结构稳定性发生改变有关〔18〕。人体肠道为不同肠道微生态群落提供了一个稳定且营养丰富的内环境,正常机体肠道微生物可抵抗炎症及病毒入侵,当在疾病刺激下,肠道微生态被打破,导致肠道菌群失衡,通过调节肠道失调下肠道所产生的内毒素和其他有害细菌的存在决定CRF的整体炎症状态,还会影响营养吸收、新陈代谢、免疫反应、炎症和对病原体的反应,导致感染和慢性疾病〔19〕。CRF患者肠道菌群失调的表现为乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌减少,大肠杆菌、肠球菌等致病菌增加。由于进行性肾衰竭,代谢毒物不能有效通过肾脏充分排泄,滞留体内导致产生尿毒症毒素,进入肠腔从而损伤肠道上皮屏障结构和功能,致使肠壁通透性增加,释放大量炎症因子等,加重肠黏膜屏障本身的炎性损伤。已有研究证实〔20〕,在尿毒症状态下大鼠的肠道菌群会发生改变,同时伴有炎症因子高表达。钟瑜萍等〔21〕研究提示,大黄、黄芪可改善CRF大鼠肠黏膜损伤及通透性,从而改善肠道菌群。肠道菌群紊乱会促进炎症增加,ERK1/2-GSK3β-NFκB具有抑制炎症的作用,本文认为,芪黄苁蓉通便散贴可能是通过抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路,减少炎症水平,从而改善肠道菌群微环境。

综上,芪黄苁蓉通便散贴可能是通过抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路激活,改善CRF大鼠肠道菌群及肾功能。